芦蒿（Artemisia selengens Turcz.）又名萎蒿、蒌蒿、藜蒿等，为菊科蒿属多年生草本植物，近10年 作为野生蔬菜被大面积地种植。芦蒿单价高，每667 m²产值可达万元，但是随着芦蒿集约化种植程度的 增加，部分芦蒿连作地土传病害发病率逐年增加，严重地块发病率高达90%，直接导致芦蒿绝收，给种植 户造成很大的损失^[1]。对发病芦蒿的田间调研显示，芦蒿主要采用茎秆扦插的方式繁殖栽培，每公顷扦 插的茎秆数量在70万~150万株，茎秆形成的第一茬芦蒿不能食用，而扦插苗在土壤中形成的匍匐茎发育 形成的鲜嫩的芦蒿可供食用。扦插的茎秆是成熟的芦蒿茎秆分段切成，茎秆切面上存在大量的导管、筛 管等直接暴露在土壤中，很容易受到土壤病原菌的侵染，即使采用多菌灵等杀菌农药浸泡，茎秆扦插于 连作土壤10~50 d时间内，形成的植株仍会陆续发病、萎蔫。发病扦插茎秆的韧皮部为褐色，形成大量黏 胶状物质，使水分运输能力丧失。而地下匍匐茎再次形成的植株，发病率则相对较低。减少土传病原菌 侵染扦插茎秆对于防控芦蒿连作地扦插苗病害十分重要。

本课题组通过对发病芦蒿扦插苗中病原菌的分离和鉴定，确定病原菌为尖孢镰刀菌^[1]，进一步对连作芦 蒿土壤中尖孢镰刀菌的研究显示，芦蒿种植土壤中土著尖孢镰刀菌数量高达10³ cfu·g^-1土壤，低发病 或者不发病土壤中尖孢镰刀菌多为不致病或者低致病菌株，一旦连作地发生病害，土壤中高致病性尖孢 镰刀菌数量显著增加。芦蒿的食用部分主要是茎，而且芦蒿生育周期短，采用氯化苦（CCl₃NO₂）、溴甲 烷和甲基溴等熏蒸杀菌或者应用杀菌剂五氯硝基苯及其复配的药剂、多菌灵、恶霉灵等传统杀菌剂以及 新合成的农药杀灭土壤中病原菌^{[2, 3]}，对食品安全构成严重的威胁。采用淹水、暴晒、微波消毒、火焰 消毒等方法减少土壤尖孢镰刀菌数量，由于技术不太成熟，很难大面积推广使用。为了减少防治芦蒿连 作病害农药的使用，提高食品安全，本项目拟通过分离芦蒿枯萎病的生防微生物，同时测定该微生物形 成的生物有机肥对扦插苗和土壤中的尖孢镰刀菌数量和芦蒿抗病性相关酶活性的影响，试验结果有利于 芦蒿连作病害的生物防控。

采集芦蒿发病连作地中未发病植株根际土壤或者贫瘠的粉砂土壤，4 ℃保藏。以尖孢镰刀菌NJ13菌株（ 河海大学农业环境研究所提供）为目标菌株，分别采用马丁氏培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和高氏一号 培养基分离真菌、细菌和放线菌菌株，通过对峙培养，筛选出能够显著抑制尖孢镰刀菌NJ13菌株生长的 菌株D9。D9菌株16S rDNA序列扩增采用通用引物BSF（27f）：（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）^[4]，应用软件MEGA 6.0.5构建系统发育树^[5]。

分离的细菌菌株D9采用肉汤培养基，37 ℃，150 r·min^-1培养18 h。培养液采用0.45 μm的无菌细菌滤 器过滤，除掉培养液中的细菌菌体。将滤液和40 ℃的灭菌水琼脂培养基混合，将无菌的载玻片分别放入 水琼脂培养基（对照）和混合了细菌培养液滤液的水琼脂培养基中，取出载玻片，剥去载玻片一面的培 养基，在有培养基的载玻片的一面滴加等量的尖孢镰刀菌孢子液，28 ℃培养12 h，采用显微镜观测尖孢 镰刀菌分生孢子的萌发率，萌发率为芽管长度超过分生孢子短径的一半的孢子占所有孢子的比例。将过 滤后的细菌培养液与40 ℃的PDA培养基彻底混合，倒培养基，培养基上接种直径5 mm的、培养了5 d的尖 孢镰刀菌边缘的菌饼，以未混合滤液的PDA培养基作为对照，测定不同处理培养基上尖孢镰刀菌菌落直径 ，计算菌丝的生长速度。

试验地选择南京市栖霞区八卦洲街道，发病田块上季芦蒿发病率接近100%，基本没有产量，是当地发病 最重的田块之一。试验设置3个处理，分别为：（1）对照处理，连作土壤施用复混肥（16-16-16）作为 底肥，施用量1 500 kg·hm^-2，追肥施用尿素，施用量750 kg·hm^-2；（2）有机肥处理，连作土壤施用 有机肥（N 1.7%，P₂O₅ 1.8%，K₂O 1.7%）作为底肥，施用量为15 t·hm^-2，追肥施用尿素，施用量750 kg·hm^-2；（3）生物有机肥处理，连作土壤施用D9生物有机肥作为底肥（N 1.7%，P₂O₅ 1.8%，K₂O 1.7%，D9含量为2.7×108 CFU·g^-1），施用量为15 t·hm^-2，追肥施用尿素，施用量750 kg·hm^-2。

试验小区面积为180 m²，中间用宽50 cm、深50 cm的排水沟分隔，每个处理3个重复，试验选用大叶蒿品 种，于2014年8月下旬插苗，扦插苗密度为75万株·hm^-2，芦蒿预计的上市时间为次年的2—3月份（春节 期间）。

采用改良的Komada选择性培养基^[6]进行尖孢镰刀菌数量的测定，培养基的配方为：KH₂PO₄ 1 g，KCl 500 mg，MgSO₄ 500 mg，EDTA （C₁₀H₁₆N₂O₈） 100 mg，D-半乳糖20 g，L-天冬酰胺2 g，自来水1 000 mL，120 ℃灭菌15 min，培养基冷却到50 ℃时候添加以下培养液：1 g Na₂B₄O₇，1 g PCNB（五氯硝基 苯），500 mg 牛胆盐，300 mg 链霉素，100 mg 氯霉素，10%磷酸调节至pH 4。

芦蒿扦插茎秆埋入土壤中的部分用75%的乙醇进行表面消毒3次，然后用粉碎机粉碎。采用梯度稀释法测 定茎秆和根际土壤中尖孢镰刀菌数量，将10 g土壤或者茎秆粉碎物放到90 mL无菌水中，室温震荡20 min ，吸取稀释10¹、10²倍和10³倍稀释液0.1 mL涂布到选择性培养基上，计数培养基上生长的菌落数量。

根据芦蒿枯萎病发病程度不同将病情指数分为3级：0级，无叶片萎蔫；1级，≤20%叶萎蔫；2级，21%≤ 叶片萎蔫≤100%。测定芦蒿扦插50 d后，不同处理芦蒿的病情指数。发病率计算参照文献[7]方法：

在试验小区内芦蒿开始出现零星的发病症状时，采集不同处理芦蒿的叶片，液氮保存。采用还原糖法 （DNS 法）^[8]测定叶片的几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性。几丁质酶活力单位U 定义为37 ℃下每1 h 水解胶状几丁质产生1 μmol N-乙酰葡萄糖胺所需的酶量。β-1，3-葡聚糖酶酶活力单位U 定义为每1 h 还原昆布多糖释放出1 μg 葡萄糖为1 个酶活力单位。

试验数据用SPSS 18.0（USA）统计软件进行方差分析，差异显著性比较采用Duncan′s 测验，绘图使用 Excel 软件。

D9菌株在PDA培养基上和NJ13对峙培养的效果如图 1所示，D9能够显著地抑制NJ13菌株的生长，形成较大 的抑菌圈。

图 1 D9菌株抑制病原菌的效果图 Figure 1 Growth inhibition of the pathogen NJ13 by the D9

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D9菌株的扫描电镜照片如图 2所示。基于16S rDNA序列对D9菌株进行鉴定，PCR扩增获得的16S rDNA序列 NCBI GenBank的登录序列号为KR780033。将测序结果在GenBank数据库中进行同源性检索，再用MEGA 6.0.5分析、绘制系统发育树（图 3），结果表明，D9菌株与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（登录号 AP012496.1）的同源性达99%，D9菌株鉴定为枯草芽孢杆菌B. subtilis。

图 2 D9菌株的扫描电子显微镜照片（×50 k） Figure 2 Photograph of scanning electron microscope of D9（×50 k）

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图 3 D9菌株的16S rDNA序列的系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA sequence of D9

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枯草芽孢杆菌D9的代谢物对尖孢镰刀菌孢子的萌发和菌丝生长的影响如表 1所示。相较于对照处理，水琼 脂培养基和PDA培养基添加了5%的D9菌液对尖孢镰刀菌的孢子萌发和菌丝生长均没有产生显著的影响 （P>0.05），但是添加更高浓度的菌液（>10%）均表现出对孢子萌发和菌丝生长速度的显著抑制作用 （P < 0.05）。

表 1 枯草芽孢杆菌D9代谢物对尖孢镰刀菌孢子萌发和菌丝生长的影响 Table 1 The effect of second metabolites of D9 on the conidia germination and hypha elongation of F.oxysporum

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不同处理芦蒿发病率如图 4所示，对照、有机肥处理和生物有机肥处理的发病率分别为91.0%、20.7%和 2.6%。有机肥和生物有机肥对芦蒿的枯萎病的防治率分别为77.3%和97.1%，而且相较于有机肥，生物有 机肥对于芦蒿枯萎病的防控效果更显著（P < 0.05）。

不同小写字母代表处理之间差异的显著性。下同 Different small letters indicate significant difference among treatments图 4 不同处理芦蒿枯萎病发病率 Figure 4 The disease incidence of A. selengens in different treatments

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相较于对照处理，有机肥处理根际土壤病原菌数量增加了3.1%（图 5），但是茎内病原菌数量显著降低（ P < 0.05）。相较于对照和有机肥处理，生物有机肥处理根际土壤中尖孢镰刀菌数量分别降低了35.7%和 27.8%（P < 0.05），茎秆内尖孢镰刀菌数量分别降低了93.7%和63.6%（P < 0.05）。

图 5 不同处理尖孢镰刀菌数量 Figure 5 Population of F. oxysporum in the different treatments

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测定的芦蒿叶片几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活如图 6所示。相较于对照处理，施用有机肥对芦蒿叶片的 几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活力没有显著影响（P＞0.05）。生物有机肥处理的芦蒿叶片的几丁质酶和 β-1，3-葡聚糖酶活力显著高于对照（P < 0.05），酶活性分别提高了2.2倍和1.7倍。生物有机肥能够显 著提高芦蒿扦插苗的抗病性酶活。

图 6 不同处理芦蒿叶片几丁质酶活和β-1，3-葡聚糖酶活 Figure 6 Enzyme activity of chitinase and β-1，3-gluanase in the leaf of A. selengens

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芦蒿采用茎秆扦插的方式繁殖栽培，依靠地下匍匐茎形成新的植株，扦插茎秆截面形成天然的创口，极 容易受到连作土壤中病原微生物的侵染^[1]。由于土壤具有很强的净化能力，蘸在扦插茎秆表层的杀菌剂 ，很容易被土壤微生物分解而失去功效^{[9, 10]}。因此，开发生防微生物的生物有机肥，防止连作土壤中 病原微生物侵染扦插茎秆是一条高效可行的途径。

扦插茎秆在扦插后几天内很容易被土壤中病原菌侵染，依靠生防微生物生长过程中产生的竞争作用或者 寄生作用，不利于病原菌的控制，而分离到的枯草芽孢杆菌D9菌株产生的拮抗物质能够显著地抑制尖孢 镰刀菌的孢子萌发和菌丝生长，因此，开发出具有D9发酵产物及其菌体的产品，有利于提高生防芦蒿枯 萎病的效率。芦蒿每公顷扦插茎秆在70万~150万株，密度较大，需要将生防菌株均匀地施入表层土壤， 因此，生物有机肥型的生防产品有利于生防微生物的分散，而且有机质能够为生防菌株提供能量，可以 让生防菌株在土壤持续合成分泌拮抗物质^{[2, 3, 7, 11]}。有机肥和生物有机肥防病效果显示，大量施用 有机肥也能够显著降低芦蒿发病率，本研究显示，当地发病较重的田块，有机肥应用很少，这就导致土 壤很少有新的外源微生物进入，无法和病原微生物进行有效地竞争。生物有机肥处理基本没有发病（发 病率2.6%），说明生防菌株D9很好地抑制了病原菌的侵染。

对扦插苗内部的尖孢镰刀菌数量测定显示，有机肥和生物有机肥处理的尖孢镰刀菌数量均显著减少，而 且生物有机肥处理尖孢镰刀菌数量更低，应该是源于有机肥中大量的微生物占据了尖孢镰刀菌侵染的“ 生态位”^{[12, 13, 14]}，生物有机肥中生防菌株D9进一步地抑制了尖孢镰刀菌在“生态位”的定殖。对根际土 壤和茎秆内的尖孢镰刀菌数量测定显示，相较于对照处理，有机肥处理根际土壤的尖孢镰刀菌数量增加 ，有机肥没有抑菌效果，可能是有机肥可以为土壤病原菌增生提供能源^[13]。生物有机肥由于含有大量 的生防菌株D9，产生的抑菌物质抑制了病原菌的生长，这可能是生物有机肥处理根际土壤病原菌降低的 原因。

测定茎秆中病原菌的数量显示，生物有机肥处理茎秆中也存在尖孢镰刀菌，而且数量高于非连作土中健 康芦蒿扦插苗（本课题组测定），但是生物有机肥处理绝大部分芦蒿扦插植株都没有表现出发病的症状 ，这可能是生物有机肥处理芦蒿扦插植株抗病性酶活力较高的原因，这与相关的报道一致^{[15, 16]}，D9菌 株诱导芦蒿产生更高的抗病性相关酶活力，抑制了病原菌在扦插苗内部侵染致病。部分尖孢镰刀菌可以 通过导管等植物组织等进入扦插苗内部，虽然繁殖增生能力被显著地限制，但是潜伏在植株组织内的病 原菌始终对于植株的健康构成威胁，因此，进一步地研究生防菌株的应用方法，减少扦插苗创面病原菌 的侵染，对于连作地芦蒿扦插苗枯萎病的控制十分必要。

相较于不施用生物有机肥的对照土壤，施用枯草芽孢杆菌D9生物有机肥的芦蒿扦插苗根际土壤和茎秆中 尖孢镰刀菌数量分别降低了35.7%和93.7%，几丁质酶和葡聚糖酶活性分别增加了2.2倍和1.7倍，生防效 果达到97.1%，试验结果为生防连作芦蒿扦插苗枯萎病提供一条高效可行的途径。