近年来土壤健康问题越来越受到人们的重视，不健康的土壤会导致土传病害的发生，对植物造成危害。有学者研究发现土壤健康依赖于土壤微生物的功能多样性^[1-2]，土壤微生物能够调控土壤微生态平衡，有助于维持土壤健康^[3-4]。植物根系与土壤微生物接触的部分存在一个微域^[5]，在这个微域环境中，土壤微生物能够利用植物的残体分解物及根系分泌物产生碳、氮以保证自身正常的生命活动^[6-7]，同时也能够分解土壤中的有机物质释放出养分来供给植物，保证植物的健康生长。微生物与植物互惠共存的关系有利于土壤微生态系统的平衡，从而促进土壤健康^[8-9]。

微生物群落的结构、功能及其与宿主相关依赖和相互制约形成的复杂系统称为微生态系统，微生态平衡是一个生命体健康的基本前提^[10]。丁伟等^[11]指出植物病害的发生可以理解为植物的微生态失去了平衡。因此烟草患上青枯病即病原菌突破了各种屏障，进入烟株的根际部位，在烟株中大量繁殖，打破了烟株根际的微生态平衡，危害烟株的生长发育，这给烟农带来了严重的经济损失，对烟草来说是一种毁灭性的病害^[12-13]。BONILLA等^[14]的研究表明土壤微生物群落结构与植物抗病性有关，微生物群落结构好，抗病性强。施河丽等^[15]研究发现与健康烟株根际土壤相比，青枯病烟株的土壤养分含量较低，土壤pH值较高，土壤微生物多样性、有益菌的丰度也相对较低。张明宇等^[16]的研究表明有机肥能够缓解青枯病的病害程度，其主要通过提升土壤微生物多样性、改善土壤微生态来实现。林书震^[17]的研究发现烟草病害的发生会带来微生物多样性的下降和丰富度的减少。蔡燕飞等^[18]的研究发现有机肥的施用有利于土壤有益菌的繁殖，减少植物病害。韦中等^[19]的研究发现菌株RC-14能通过菜粕有机肥中的某些营养物质产生大量拮抗物质，这些物质能够抑制番茄根际青枯菌的生长，降低青枯病发病率。

近年来，大量的研究表明通过改变施肥方法、调控土壤微生态平衡可抑制病原菌的繁殖，控制土传病害的发生^[20-21]。研究表明生物炭能够调节土壤微生态环境^[22-24]。基于此，本研究比较了不同施肥条件下青枯病烟株与健康烟株根际土壤细菌群落结构的差异，明确生物炭对根际土壤微生态的调控机制，为利用生物炭调控根际土壤微生态环境、促进土壤健康、防控烟草青枯病奠定基础。

1 材料与方法 1.1 研究地点

试验于2019年2月—10月在福建省邵武市沿山镇进行，供试的烟草品种为K326，供试土壤类型为水稻土，其基本理化性质：有机质含量为18.63 g·kg^-1，速效钾含量为122.55 mg·kg^-1，有效磷含量为21.24 mg·kg^-1，全氮含量为0.18 g·kg^-1，pH值为6.29。本试验所使用的生物炭由河南省生物炭工程技术研究中心提供，该生物炭以花生壳为原料，经380~400 ℃低氧条件下连续炭化制成，生物炭的基本理化性质如表 1所示。

1.2 试验设计

试验共设置2个处理：CK（常规施肥）和T1（施用1.2 t·hm^-2生物炭+常规施肥），当烤烟进入成熟期后，烟田逐渐出现青枯病，因此开始进行青枯病烟株根际土壤微生物多样性研究。青枯病烟株根际土壤微生物多样性研究设4个处理：ZCTR（常规施肥健康烟株的根际土壤）、QKTR（常规施肥青枯病烟株的根际土壤）、ZCSW（施加1.2 t·hm^-2生物炭的健康烟株的根际土壤）、QKSW（施加1.2 t·hm^-2生物炭的青枯病烟株的根际土壤），ZCTR、QKTR两个处理于CK小区取样，ZCSW、QKSW两个处理于T1小区取样。

CK、T1处理均常规施肥：烟草专用肥用量为525 kg·hm^-2（N 12.5%、P₂O₅ 8%、K₂O 22.5%），芝麻饼肥用量为675 kg·hm^-2（N 5.8%、K₂O 1.3%），硫酸钾用量为301 kg·hm^-2，氢氧化镁用量为185.5 kg·hm^-2，钙镁磷肥用量为457 kg·hm^-2，硝酸钾用量为347 kg·hm^-2，氮磷钾比例为1∶0.78∶2.87。

1.3 土壤微生物取样及检测

在烟草移栽75 d时，用铲子将烟株周围10 cm的土壤挖至30 cm的深度，切割土壤中烟株的任何侧根，挖出烟株整个根部。将根球放入盆中，摇动根部，用铲子从根部去除土壤，将采集盆中无碎块的土壤5~10 g除去杂质，混匀过2 mm筛，保存在10 mL无菌离心管中，放入干冰中送至上海欧易生物科技有限公司进行土壤微生物多样性检测。检测方法参照文献[25]，土壤DNA提取和PCR扩增均采用试剂盒，细菌16S rRNA用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物对V3~V4可变区进行PCR扩增，扩增的程序为：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min（PCR仪：ABI GeneAmp^® 9700型）。扩增体系为20 μL，4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mmol·L^-1 dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol·L^-1），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。利用欧易生物科技有限公司平台进行测序，测序的Coverage指数均大于0.94，表明试验样本的测序覆盖度均在94%以上，样品的测序深度能够满足后续的数据分析。

1.4 烟株生长发育及病害情况

在烟草移栽75 d时，记录各个小区的烟株农艺性状。从青枯病发生的时间开始调查并记录实验小区发病的株数以及发病烟株的病情程度（烟草青枯病的发病率=发病株数/调查总株数×100%）^[19]。

1.5 数据分析

采用DPS 7.0软件分析处理数据，用R软件的Vegan包绘制热图，主成分分析采用SPSS 11.0软件。

2 结果与分析 2.1 样本的测序结果

本试验样品检测到的OTUs总数为11 011。如图 1所示，所有样本共有的OUTs总数为706，常规施肥下健康烟株的根际土壤与青枯病烟株的根际土壤2个处理共有的OTUs总数为1 087，施加1.2 t·hm^-2生物炭后健康烟株的根际土壤与青枯病烟株的根际土壤2个处理共有的OTUs总数为1 198，各个处理本身特有的OUTs总数分别为2268（ZCTR）、2 508（ZCSW）、2 320（QKTR）、2 336（QKSW）。总的来看，施加生物炭后健康烟株的根际土壤与青枯病烟株的根际土壤所共有的OTUs总数比常规施肥多。

2.2 土壤细菌群落的α多样性

由表 2可知，4个处理的Shannon指数和Chao1指数大小均表现为QKTR < ZCTR < QKSW < ZCSW，Simpson指数反之，说明无论烟株是否染病，生物炭施用均能提升根际土壤细菌α多样性和群落丰富度；从细菌α多样性来看，虽然各个处理无显著差异，但是在数值上还是出现了差距，在施肥相同的条件下青枯病烟株的根际土壤细菌α多样性均小于正常烟株根际土壤。从细菌群落的丰富度来看，ZCSW处理的Chao1指数显著大于其他处理，说明施加生物炭的健康烟株根际土壤细菌群落丰富度最大。同等施肥条件下，健康烟株的根际土壤Chao1指数均显著大于青枯病烟株的根际土壤Chao1指数。

2.3 土壤细菌群落结构

如图 2所示，对于变形菌门（Proteobacteria）来说，ZCTR处理的相对丰度相较于QKTR、ZCSW处理明显提高了1.07、3.59个百分点，QKSW处理的相对丰度相较于ZCSW处理提高了2.60个百分点；酸杆菌门（Acidobacteria）的相对丰度大小表现为QKTR > ZCTR > ZCSW > QKSW，QKTR处理的相对丰度比ZCTR、QKSW处理明显提高了1.27、3.48个百分点，QKSW处理的相对丰度比ZCSW处理明显减少了0.83个百分点；各个处理放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度大小表现为ZCTR > QKTR > QKSW > ZCSW，ZCTR处理的相对丰度相较于QKTR、ZCSW、QKSW处理分别提高了0.14、2.84、2.51个百分点；芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）的相对丰度在ZCTR处理最低，ZCSW处理最高，ZCSW的相对丰度较ZCTR处理明显提高了5.27个百分点，且QKSW处理较QKTR处理也提高了4.15个百分点。

Heatmap分析将样本按丰度的相似性进行分别聚合，用颜色的变化来表示土壤细菌种群之间的关系，红色（正值）越深代表相对丰度越高，说明土壤细菌生长受到的促进作用越强，蓝色（负值）越深代表相对丰度越低，说明土壤细菌生长受到的抑制作用越强。由图 3可以看出，QKTR3处理有利于蓝细菌（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）的生长，不利于迷踪菌门（Elusimicrobia）的生长；ZCTR3处理有利于厚壁菌门（Firmicutes）、WCHB1_60的生长；QKSW3处理不利于绿弯菌门（Chloroflexi）的繁殖；ZCSW2处理不利于变形菌门（Proteobacteria）的繁殖。

2.4 根际土壤细菌群落主成分

如图 4a所示，ZCSW、QKSW、ZCTR、QKTR处理各样本点在PC2轴上依次排开，且距离呈现先增大后减少再增大的趋势，说明施用生物炭对土壤微生物细菌群落结构有明显的影响。由箱形图（图 4b）可以看出，在PC1轴上ZCSW、QKSW两个生物炭处理之间的距离较近，且均与QKTR、ZCTR两个未施生物炭处理之间相距较远，说明生物炭施用改变了土壤微生物群落结构；QKTR、ZCTR箱形长度较短说明组内生物重复性好，ZCSW、QKSW箱形长度较长说明组内重复较差。

2.5 根际土壤细菌群落LEfSe分析

利用LEfSe差异分析筛选出四种土壤中具有显著差异的微生物（LDA阈值为2）。由图 5可知，未添加生物炭的健康烟株根际土壤（ZCTR）样本中，Perlucidibaca、Acidibacter、厚壁菌门（Firmicutes）显著富集；添加生物炭的健康烟株根际土壤（ZCSW）样本中，芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、Ignavibacteriales、绿弯菌门（Chloroflexi）显著富集；未添加生物炭的青枯病烟株的根际土壤（QKTR）样本中，放线菌门（Actinobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）显著富集；添加生物炭的青枯病烟株的根际土壤（QKSW）样本中，肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、鞘氨醇杆菌科（Sphingobacteriaceae）显著富集。

2.6 生物炭对烟株生长发育的影响

由表 3可知，在烟株成熟期时，施用生物炭有利于烟株的生长发育，并减少染病烟株的数量。施用生物炭后烟株的株高、叶长、叶宽、茎围分别较CK处理增加了11.83%、16.88%、6.70%、10.80%。T1处理青枯病的发病率也比CK处理降低了9.1个百分点。

3 讨论 3.1 健康烟株与青枯病烟株根际土壤的微生态差异

土壤微生态系统的物种多样性指数反映了微生物种群结构的复杂程度。有研究表明，微生物多样性指数越高，微生态系统的结构越复杂，稳定性越高^[26]。本研究发现对于常规施肥的土壤来说，青枯病烟株的根际土壤细菌α多样性和丰富度比健康烟株根际土壤低，与施河丽等^[15]的研究结果一致。土壤微生物多样性的降低说明根际土壤微生态系统的平衡受到破坏，这是土传病害发生的重要原因之一^[27]。由物种组成丰度图（图 2）可以看出，健康烟株与青枯病烟株根际土壤细菌门类组成基本一致，变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）是土壤中的优势菌门，这与张超等^[28]研究结果一致。由Heatmap分析结果可知，蓝细菌（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、迷踪菌门（Elusimicrobia）的生长在QKTR处理中受到明显抑制，说明生物炭能够减少与病害根际土壤相关细菌门类的相对丰度，使土壤微生态环境向健康的方向发展。

3.2 生物炭对青枯病烟株根际土壤的微生态防治机理

大量研究表明，施用生物炭具有改良土壤、保持土壤水分及养分的效果，已经成为调控土壤连作障碍和土壤健康管理的重要途径之一^[29]。本研究通过比较不同施肥条件下健康烟株与青枯病烟株根际土壤微生物群落的差异，推测生物炭对青枯病烟株的根际土壤微生态防治机制，即生物炭施入后对土壤和烟株均产生正向影响：对于烟株来说，生物炭促进烟株生长发育，提升烟株自身免疫，降低了青枯病发病率^[30]；对于土壤来说，生物炭提升了根际土壤细菌多样性，增加了细菌群落的丰富度，使土壤微生态系统向更加稳定健康的方向发展，减轻土壤病害的发生^[31]。生物炭的施用能够使有益菌（如芽单胞菌门）显著富集，定向调控烟田的根际土壤微生态，丰富土壤生态系统的微生物多样性，有利于土壤微生态系统的平衡，重建健康的土壤微生态系统，减轻或抑制烟草青枯病的发生^[32]，其作用机制如图 6所示。

4 结论

（1）烟草青枯病会降低土壤细菌多样性和丰富度，使土壤原有的有益菌数量减少，增加与青枯病相关的细菌的相对丰度，如厚壁菌门（Firmicutes）、WCHB1_60、绿弯菌门（Chloroflexi）和变形菌门（Pro⁃ teobacteria）。

（2）生物炭有效改善根际土壤细菌的群落结构，提升细菌多样性，使根际土壤富集有利于土壤健康和植物健康的细菌，构建健康的土壤微生态系统，维持土壤微生态平衡，促进烟株健康发育的同时减少青枯病的发病率。