畜禽粪便作为有机肥料施入土壤后，其残留的重金属和抗生素不仅影响土壤肥力和作物的产量与品质^[1-2]，而且最终将通过食物链危害人类的健康^[3]。土壤中的镉（Cd）主要分布在地表 0~20 cm处^[4]，且土壤中Cd的环境容量小、毒性大^[5]。2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国耕地土壤点位超标率为19.4%，主要污染物为镉、铜、镍、砷、汞、铅、滴滴涕和多环芳烃^[6]。抗生素在动物体内的分解较少，有30%~90%以母体化合物或代谢产物形式随粪便排出体外^[7-8]，使得畜禽粪便成为抗生素污染环境的主要途径之一。Morales-Muoz等^[9]借助动态微波辅助提取和在线实时监测的方法对西班牙某污染土壤进行了检测，发现在使用粪肥的土壤中环丙沙星和诺氟沙星的平均浓度分别为4.4 mg·kg^-1和8 mg·kg^-1。Zhao等^[10]对采自中国8个省（市、自治区）的大型畜禽养殖场的143个畜禽粪便样品进行了检测，结果显示所有样品中均检出环丙沙星，最大浓度为45.59 mg·kg^-1。此外，研究表明畜禽粪便中残留的高浓度抗生素和重金属会引起养殖场及周边土壤抗生素和重金属的复合污染^[11-13]。抗生素具有一个或多个官能团，并且这些官能团均可与金属离子发生络合作用，重金属-抗生素的络合作用不仅影响各自的环境行为和生物效应，而且在复合污染体系中对环境效应起主导作用，其联合毒性存在协同、拮抗，甚至加和等复杂的毒理效应^[14-16]。

人体暴露于环境中Cd的途径主要包括食用受污染的食物或饮用水、吸入土壤或空气中含Cd颗粒物质以及接触Cd烟雾和灰尘^[17-18]，其中无意的口部摄入特别是儿童户外活动时经手-口摄入被认为是土壤重金属人体暴露的重要途径之一^[19-21]。在人体健康风险评价中，基于生理学的体外实验（in vitro）模型是进行重金属生物可给性评估的有效工具。生物可给性是指在人体胃肠环境中可溶并可供吸收的重金属的含量，而生物有效性是指吸收到体内重新分布的重金属含量^[22]。由于小肠对重金属的不完全吸收，生物可给性一般大于生物有效性，但生物可给性在一定程度上能反映生物有效性。体外实验具有操作简单、快速，费用较低等优点，因而受到国内外研究者广泛关注^[23-25]。因此，利用体外实验研究土壤环境样品中重金属Cd人体生物可给性能够更加准确地评价Cd对人体健康的潜在风险。但目前有关Cd生物可给性的研究多集中在重金属单一污染上，对于复合污染的研究相对较少。因此，本研究选取环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）和重金属Cd作为土壤污染物质，基于PBET（Physiologically based extraction test）+SHIME（Simulator of human intestinal microbial ecosystems of infants）模型研究环丙沙星和Cd复合污染土壤中Cd的生物可给性，为评价土壤中抗生素和Cd复合污染对人体健康的潜在风险提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试土壤

本研究所用的无污染土壤于2017年采自河北省安新县王家寨，供试土壤为潮土，按照中国土壤系统分类为干润雏形土（Ustic cambosols）。采集0~20 cm土层土壤，土壤有机质含量为26.3 g·kg^-1，土壤pH值为7.91，碱解氮含量为112 mg·kg^-1。供试土壤未检测出Cd和环丙沙星。

1.2 土壤老化试验

采集新鲜土样过2 mm筛，充分混匀，放置于人工气候箱中25 ℃恒温培养一周，以活化土壤微生物。然后取土装盆（培养盆规格：顶部直径12.0 cm×底部直径8.5 cm×高10.0 cm），每盆装232 g鲜土，培养盆中土壤含水量为田间最大持水量的70% 左右，置于人工气候箱中25 ℃非密闭培养，并模拟实际光照周期变化（昼夜各12 h），通过称质量法补充培养盆中土壤损失的水分，以保持土壤含水量恒定。

试验共设置4个处理：CK+Cd（外源添加Cd 80 mg·kg^-1），CIPⅠ+Cd（外源添加CIP 5 mg·kg^-1+Cd 80 mg·kg^-1），CIPⅡ+Cd（外源添加CIP 25 mg·kg^-1+Cd 80 mg·kg^-1），CIPⅢ+Cd（外源添加CIP 50 mg·kg^-1+Cd 80 mg·kg^-1），3次重复。Cd添加量以目前已知肥料中含量为依据^[26]，抗生素药物添加量设定以已知畜禽粪便中CIP的含量为依据^[10]。试验分别于土壤培养的第1、30、60 d取样。培养后的土壤样品风干，一部分保存于4 ℃冰箱，用于土壤理化性质测定，另一部分保存于-20 ℃冰箱，用于后续体外培养试验。

1.3 体外模拟试验

主要采用PBET+SHIME模型中的方法，具体操作步骤如下：

（1）胃阶段：配制模拟胃液（以配制600 mL胃液为例，分别称取柠檬酸0.3 g、苹果酸0.3 g、乳酸252 μL、冰乙酸300 μL置于烧杯中，加水600 mL，用12 mol·L^-1浓HCl调pH至1.5，再加胃蛋白酶0.75 g，混匀，添加NaCl 5.265 g），称取土样0.3 g于50 mL的离心管内，将30 mL模拟胃液和土样混合于离心管内，使得固液比为1∶100，每个样品3个平行，混匀微调pH（1.5±0.1）后，置于37 ℃、150 r·min^-1的恒温振荡仪中（0.5 h时测定pH）。在1 h时，吸取反应液10 mL，以4 000 r·min^-1的速度离心10 min，重复3次，过0.45 μm滤膜，-20 ℃保存待测。

（2）小肠阶段：用NaHCO3粉末将胃阶段反应液pH调至7.0，加入胰酶0.018 g、胆盐0.06 g，继续置于37 ℃、150 r·min^-1的恒温振荡仪中，2 h时测定pH，并用1 mol·L^-1 HCl或NaHCO3微调，使pH维持在7.0± 0.1。在4 h时，吸取反应液10 mL，离心，过0.45 μm滤膜，-20 ℃保存待测。

（3）结肠阶段：将小肠液转移至100 mL的厌氧血清瓶内，并从SHIME模型的降结肠阶段吸取30 mL菌液加入，使土液比为1∶100，迅速通入氮气20 min以保证厌氧条件，加盖密封后继续置于37 ℃、150 r· min^-1的恒温振荡仪中。在48 h时，吸取反应液10 mL，离心，过0.45 μm滤膜，-80 ℃保存待测。

1.4 计算方法

土壤中重金属Cd在模拟胃阶段和肠阶段的生物可给性计算公式如下：

式中：BA为Cd的生物可给性，%；C_IV是模拟实验中各阶段Cd的浓度，mg·L^-1；V_IV为各阶段反应器中反应液的体积，L，本实验为0.03 L；T_S是土壤样品中Cd的总量，mg·kg^-1；M_S为加入反应器中的土样的质量，kg，本实验为0.000 3 kg。

1.5 数据处理

所有数据均采用Excel 2016整理，使用SPSS 22.0进行单因素ANOVA方差分析，采用Duncan方法进行显著性检验，用Origin 2018软件进行作图。数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析 2.1 不同老化时间复合污染土壤中Cd的生物可给性 2.1.1 第1 d重金属Cd在胃肠阶段的生物可给性

由图 1可知，D1复合污染土壤中不同浓度CIP对Cd在胃肠阶段的生物可给性影响不同。胃阶段各处理Cd生物可给性无显著差异。在小肠阶段，随着CIP浓度的增加，重金属Cd的生物可给性呈逐渐降低的趋势。在结肠阶段，没有检出溶解态Cd。

2.1.2 第30 d重金属Cd在胃肠阶段的生物可给性

由图 2可知，D30复合污染土壤中不同浓度CIP对Cd在胃肠阶段的生物可给性影响不同。胃阶段CIPⅡ+Cd处理Cd生物可给性最大，相较于CK+Cd增加10.36个百分点，但差异不显著（P>0.05）；CIPⅠ+Cd处理和CIPⅢ+Cd处理生物可给性相较于对照处理分别增加5.82个百分点和5.33个百分点，但差异不显著（P>0.05）；在小肠阶段，随着CIP浓度的增加，Cd在小肠阶段的生物可给性呈现逐渐降低的趋势，但与对照处理之间差异均未达到显著水平（P>0.05）；在结肠阶段，随着CIP浓度的增加，各处理的生物可给性呈现增加的趋势，其中CIPⅢ+Cd处理Cd生物可给性最大，相较于对照处理显著增加1.73倍（P < 0.05），CIPⅡ+ Cd处理相较于对照处理显著增加1.56倍（P < 0.05）。

2.1.3 第60 d重金属Cd在胃肠阶段的生物可给性

由图 3可知，D60复合污染土壤中不同浓度CIP对Cd在胃肠阶段的生物可给性影响不同。胃阶段CIPⅠ+Cd处理生物可给性最大，为91.32%，相较于CK+Cd增加3.82个百分点，但差异不显著（P>0.05），CIPⅡ+Cd处理和CIPⅢ+Cd处理Cd生物可给性相较于对照处理均降低，但差异不显著（P>0.05），高浓度的CIP导致Cd在胃阶段的生物可给性降低；在小肠阶段，随着CIP浓度的增加，Cd的生物可给性呈现逐渐增加的趋势，其中CIPⅢ+Cd处理Cd生物可给性最大，为31.30%，相较于对照处理显著增加2.38倍（P < 0.05），CIPⅡ+Cd处理Cd生物可给性相对于对照处理显著增加1.60倍（P < 0.05）；在结肠阶段，随着CIP浓度的增加，各处理的生物可给性呈现增加的趋势，其中CIPⅢ+Cd处理Cd生物可给性最大，为9.19%，各处理Cd生物可给性相较于对照处理差异均未达到显著水平（P>0.05）。

2.2 复合污染土壤中胃阶段Cd的生物可给性动态变化

表 1为胃阶段不同停留时间Cd的生物可给性动态变化。通常，在PBET方法中，土壤在胃阶段的停留时间设定为1 h，因此，本研究考察了0~60 min胃阶段Cd生物可给性动态变化。由表 1可得，不同处理Cd在胃阶段生物可给性的变化不同，且随着在胃中停留时间的增加，Cd的生物可给性呈增加的趋势，但增幅有所不同。胃阶段停留20 min时，各处理土壤中Cd的生物可给性变幅最大，Cd生物可给性在停留60 min时达到最大。各处理Cd生物可给性变化均是先快后慢，在胃阶段生物可给性的变化趋势相似，而且同一停留时间不同处理间Cd生物可给性差异均不显著（P>0.05）。

3 讨论

不同老化天数复合污染土壤中Cd的生物可给性有所差异。随着土壤老化时间的延长，Cd的生物可给性不断降低，其潜在环境风险也相应地下降。研究表明，随着老化时间的延长，土壤中有效态Cd含量逐渐下降最后趋于稳定^[27-30]，而使其环境风险也相应降低。同时也有研究证明，喹诺酮类抗生素可以与很多金属离子形成稳定的络合物，影响各自的生物效应^[31-32]。本研究发现Cd在小肠阶段的生物可给性低于胃阶段。可能是因为从胃阶段到小肠阶段in vitro pH升高，以及胰酶和胆盐的加入，使得土壤对Cd离子的吸附力加强，而且Cd与其他金属离子形成沉淀的机会增大，从而导致肠液中Cd的浓度降低，这与其他众多研究结果相一致^{[19-20, 25]}。复合污染各处理土壤中Cd生物可给性与CK+Cd相比有所不同，其原因可能是CIP有多个官能团，并且这些官能团均可与金属离子发生络合作用，Cd-CIP的络合作用影响了Cd的生物效应^[33-34]。随着CIP浓度的增加，D30胃阶段Cd的生物可给性呈逐渐增大的趋势，可能是由于吸收了完整的CIP-Cd复合物，该结果与黄日祥^[35]研究四环素能促进金属矿物溶解的结果一致，其研究发现四环素通过表面结合吸附到金属矿物表面，从而促进金属矿物的溶解。D30小肠阶段Cd的生物可给性呈逐渐降低的趋势，可能是因为CIP与Cd离子的络合反应，在加入CIP后引起土壤中游离态Cd离子含量减少。小肠阶段D60各处理Cd生物可给性与D30各处理Cd生物可给性变化趋势相反，D60小肠阶段的Cd的生物可给性相较于对照呈逐渐增加的趋势，这可能是因为CK+Cd处理土壤中Cd的老化特征表现为有效态Cd含量在30~60 d内快速降低^[29]，而且有研究表明不同浓度组合条件下，CIP与Cd反应会生成不同的络合物^{[31, 36]}。此外，污染物在特定时间的生物可给性可能无法全面反映人体胃阶段的动态溶解和吸收情况，因此本研究考察不同停留时间（20、40、60 min）生物可给性动态变化。结果显示，各处理复合污染土壤中Cd的生物可给性变化速率均呈先快后慢趋势，与尹乃毅等^[37]的研究结果基本一致。此外，在胃阶段Cd生物可给性动态变化研究中，由于in vitro pH较低，有利于土壤中Cd的溶出，故20 min时Cd的生物可给性变幅均很高。不同老化天数条件下不同停留时间的生物可给性有所差异，这可能是因为CIP-Cd有机物络合态的溶解差异，而且土壤中金属最先溶出的形态为可交换态，之后碳酸盐结合态溶解会释放出大量的Cd离子，而且各形态之间可能会相互转化，进而影响金属的溶出率。

4 结论

（1）环丙沙星和Cd复合污染土壤中Cd的生物可给性在胃阶段较高，在小肠和结肠阶段较低。

（2）环丙沙星的添加对胃阶段Cd的生物可给性无显著影响，而对小肠和结肠阶段Cd的生物可给性有一定的影响，与未添加环丙沙星的对照处理相比，添加25、50 mg·kg^-1环丙沙星显著提高了老化30 d结肠阶段和老化60 d小肠阶段Cd的生物可给性。

（3）胃阶段不同浓度环丙沙星与Cd复合污染土壤中，Cd的生物可给性随停留时间的动态变化不同，但均呈先快后慢趋势。