2020, Vol. 37
2. 广西师范大学生命科学学院, 广西桂林 541006
2. College of Life Science, Guangxi Normal University, Guilin 541006, China
由于纳米材料具备独特的物理及化学特性，纳米产品在社会生产生活中应用越来越广泛。其中应用最广泛、使用最多的三种纳米材料是nSiO2（纳米二氧化硅）、nTiO2（纳米二氧化钛）和nZnO（纳米氧化锌）。据报道，2012年我国通过气相法生产的nSiO2约为5.23万t，其主要用于电子、橡胶、涂料、环保等领域[1]。Keller等[2]通过调查研究得出2010年全球nTiO2和nZnO的产量分别为83 500~88 000 t和31 500~34 000 t，这两种纳米材料均可用于防晒霜、抗菌涂料和食品包装等产品中[3-4]。
随着纳米材料的广泛应用，纳米产品的普及给人们生活带来益处的同时，也对生态系统产生潜在的危害。近几年，国内外大量文献报道了纳米材料的环境生态效应，但多集中于水环境[5-8]。而农业上的喷洒、灌溉会将水体中的纳米材料带入土壤，另外纳米农药和纳米肥料的施用也会使纳米材料进入土壤。由于纳米材料在土壤中迁移能力较弱，其在土壤中的含量远高于水体[9]。据估计，2010年全球约有86 500 t的纳米材料通过各种途径被释放到土壤中，其中约有10 600 t nSiO2、38 200 t nTiO2和8 700 t nZnO[2]。Gottschalk等[9]通过模型预测土壤中nTiO2和nZnO含量年增长速率分别为0.3~1.3、0.03~0.09 μg·kg-1；有调查显示，nTiO2和nZnO在活性污泥中的含量分别达到57.0~64.7 mg·kg-1和433~802 mg·kg-1 [10]。
土壤中的纳米材料可进入生物细胞，通过释放金属离子、产生活性氧、吸附其他污染物等直接或间接作用对植物和微生物产生影响，进而影响土壤中营养元素向植物中转移，从而影响植物的生长[11-12]。孟萍[13]通过透射电镜观察和X射线能谱仪分析发现，添加到土壤中的nTiO2会进入西兰花幼苗根部细胞，并影响其根系分泌物的种类和数量；刘雪琴[14]也发现添加到土壤中的nZnO会进入玉米根和叶片细胞中，诱导植株细胞内的活性氧自由基（ROS）含量的增加；Dimkpa等[15]发现nCuO和nZnO在沙土中会分别溶解出Cu和Zn，并对植物产生氧化损伤，抑制植物生长；李琳慧[16]研究发现，nTiO2对土壤中氨化细菌、硝化细菌、自生固氮菌具有抑制作用，同时也降低了土壤脲酶、蛋白酶、硝酸还原酶、脱氢酶的活性。但也有研究表明nTiO2可以降低水稻根对Cd的吸收，减少Cd在水稻叶的积累，减轻Cd对植物的毒性[17]。
目前关于纳米材料对土壤环境的生态效应的研究相对缺乏，因此，本研究取水稻田间土采用盆栽实验，通过向土壤中添加三种常用纳米材料，探讨土壤环境中纳米材料对水稻生长、植物养分及土壤肥力的影响，以期为纳米材料在土壤环境中的生态效应评价提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料三种纳米材料（nSiO2、nTiO2、nZnO）均购自皓锡纳米科技（上海）有限公司。其透射电镜（TEM）图见图 1（由皓锡纳米科技有限公司提供），具体性质如表 1所示。
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图 1 三种纳米材料的TEM图 Figure 1 The TEM images of three nanomaterials |
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表 1 三种纳米材料基本信息 Table 1 Basic information on the three nanomaterials |
供试水稻品种为桂育8号，发芽率>90%，购自广西农业科学院；供试土壤采自广西桂林会仙镇水稻田（东经110°11′59″，北纬25°05′11″），去除表层土壤，采集5~20 cm深度的土壤，在室内风干，去除小石块、植物组织和杂物，过2 mm筛备用。供试土壤基本理化性质：pH 5.74，有机质4.86%，全氮3.37 g·kg-1，全磷1.91 g·kg-1，全钾16.1 g·kg-1。
1.2 试验方法分别称取0.5、1 g和2 g纳米材料加入400 mL无菌水中，采用超声波细胞破碎仪在400 W的条件下超声分散20 min，然后将400 mL的纳米分散液加入到1 kg过2 mm筛的水稻土中，边加边混匀，即得到0.5、1、2 mg·g-1三种（低、中、高）浓度纳米材料的土壤。
选取颗粒饱满大小相近的水稻种子，先用自来水冲洗干净，再用10%的H2O2浸泡10 min，然后用无菌水冲洗4~5次，用无菌水浸种12 h，将含有不同浓度（0、0.5、1、2 mg·g-1）三种纳米材料的土壤装入培养盒中（培养盒长×宽×高=18 cm×13 cm×6 cm），将浸泡好的种子种植在其中，每盒12穴，每穴3粒种子，每个处理3个重复，共30盒。于25 ℃模拟自然光照（光照14 h，黑暗10 h）培养30 d，每3 d补加一次Hoagland营养液，每次补加100 mL，培养期间每日浇水100 mL，保持培养箱湿度为65%~75%。
将培养30 d的水稻幼苗用去离子水清洗3~5次，用吸水纸吸干，将根部剪去后用直尺测量其株高，并立即测量鲜质量，105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干24 h至恒质量，取出测定干质量。烘干的叶子磨碎过0.21 mm筛，采用鲁如坤[18]的方法测定水稻叶子N、P、K含量。
将培养水稻后的土壤混匀后取一部分风干，取出残留的水稻根系，过筛后采用鲁如坤[18]的方法测定土壤pH、有机质、有效氮、有效磷和有效钾含量；采用关松荫[19]的方法测定土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶及酸性磷酸酶活性。
1.3 数据分析用Excel 2003处理数据，采用SPSS 20.0中的ANOVA进行单因素方差分析，并用Duncan多重比较法进行差异显著性分析，用Origin 8.0绘图。
2 结果与分析 2.1 纳米材料对水稻幼苗生长的影响三种纳米材料对水稻幼苗的各项生长指标的影响各不相同（图 2）。与不添加纳米材料的对照相比，土壤中添加三种浓度的nSiO2和nTiO2都对水稻幼苗鲜质量影响不显著；而添加0.5 mg·g-1 nZnO处理显著增加了幼苗鲜质量，增幅24.94%，但添加1 mg·g-1和2 mg·g-1的nZnO时，水稻鲜质量分别降低8.97%（P> 0.05）和5.86%（P>0.05）。与对照相比，三种浓度的nTiO2处理对幼苗的干质量影响不显著；但是nSiO2和nZnO处理都表现出低浓度增加幼苗干质量和高浓度降低幼苗干质量的现象。土壤中添加2 mg·g-1 nSiO2或0.5 mg·g-1 nTiO2均显著降低水稻幼苗的株高，分别降低7.12%和4.01%；添加低浓度的nZnO显著增加幼苗的株高，增长9.71%，而添加中、高浓度的nZnO显著降低幼苗的株高，分别降低了8.51%和6.67%。
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同种材料不同小写字母表示不同浓度处理间差异显著（P < 0.05）。下同 Different lowercase letters for the same nanomaterial indicate significant differences among different concentration treatments(P < 0.05). The same below 图 2 三种纳米材料对水稻幼苗生长的影响 Figure 2 Effect of three nanomaterials on growth of rice seedlings |
如图 3所示，三种纳米材料中nZnO处理对水稻幼苗N、P、K三种营养元素含量的影响最大。与无纳米材料的对照组相比，添加各种浓度的nTiO2都对水稻幼苗N含量无显著影响；添加低、高浓度的nSiO2均显著降低幼苗N含量，与对照相比分别降低10.16%和18.83%，而1 mg·g-1的nSiO2处理幼苗N含量增加不显著；nZnO处理对水稻幼苗N含量影响与nSiO2相似，与对照相比，低、高浓度处理幼苗N含量分别降低10.50%和15.32%，中浓度的nZnO处理水稻幼苗N含量增加7.96%。与对照相比，三种浓度的nSiO2、nTiO2和nZnO处理均增加水稻幼苗P含量（2 mg·g-1 nSiO2处理除外）。nSiO2处理水稻幼苗P含量随着土壤中添加的nSiO2增加而逐渐降低，但是各浓度处理间差异并不显著；nTiO2处理与nSiO2处理正好相反，水稻幼苗P含量随着土壤中添加的nTiO2增加而逐渐增加；水稻幼苗P含量受nZnO影响最显著，与对照相比，土壤中添加三种浓度的nZnO均显著增加幼苗P含量，分别增加12.75%、20.59%和17.50%。与不添加纳米材料的处理相比，土壤中添加nSiO2和nTiO2对水稻幼苗K含量无显著影响；但水稻幼苗K含量受nZnO影响显著，三种浓度处理幼苗K含量分别降低15.38%、13.08%和17.08%。
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图 3 三种纳米材料对水稻幼苗营养元素含量的影响 Figure 3 Effect of three nanomaterials on the nutrient content in rice seedlings |
三种纳米材料的添加对土壤pH的影响具有差异（表 2）。随着土壤中添加的nSiO2浓度增加，土壤pH逐渐降低，当土壤中添加1、2 mg·g-1 nSiO2时，土壤pH显著低于对照组；随着土壤中添加的nTiO2浓度增加，土壤pH呈上升趋势，但各处理的pH都显著小于对照组；添加高浓度的nZnO显著增加土壤pH，但低、中浓度nZnO处理对土壤pH的影响并不显著。土壤中添加nSiO2降低了土壤有机质含量，且随着添加浓度的增高而逐渐降低，降幅为1.17%~4.48%；添加三种浓度的nTiO2处理后土壤有机质含量均小于对照处理，尤其是低、中浓度的处理差异显著，分别降低6.43%、6.43%；添加0.5、1 mg·g-1的nZnO降低土壤有机质含量，但当添加的nZnO浓度增加到2 mg·g-1时，土壤有机质含量高于对照处理，但三种浓度nZnO处理的有机质含量与对照处理的差异均不显著。
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表 2 纳米材料对水稻土壤理化性质的影响 Table 2 Effect of nanomaterials on the physical and chemical properties of rice soil |
与对照相比，添加中、高浓度的nSiO2处理均显著增加土壤中有效氮的含量，分别增加了5.43%、4.65%，但低浓度的nSiO2对土壤中有效氮的含量影响不显著；三种浓度的nTiO2和nZnO处理对土壤中有效氮含量的影响并不显著。随着土壤中nSiO2的添加量增加，土壤中有效磷的含量总体为增加的趋势，增幅为4.88%~7.90%，当添加浓度增加到2 mg·g-1，土壤中有效磷的含量显著高于对照处理；土壤中有效磷的含量随着土壤中nTiO2的添加量增加呈现逐渐降低的趋势，但各处理与对照之间的差异不显著；nZnO的添加对土壤中有效磷含量的影响正好与nSiO2处理相反，随着nZnO的浓度增加土壤中有效磷的含量呈现显著降低的趋势，分别降低了3.60%、6.39%和7.43%。三种浓度的三种纳米材料对土壤中有效钾含量影响均不显著。
2.4 纳米材料对水稻土壤酶活性的影响如图 4A所示，与不添加任何纳米材料的对照组相比，三种纳米材料的添加均显著提升土壤过氧化氢酶活性。土壤过氧化氢酶活性随nSiO2浓度增加逐渐增大，nZnO处理也表现出显著增大的趋势，但nTiO2处理间差异不显著。随着nSiO2浓度增加，土壤蔗糖酶活性也逐渐增强，由低浓度的抑制效应逐渐转变为促进效应；土壤蔗糖酶活性随nTiO2处理浓度变化的趋势与nSiO2处理相反，但与对照相比，添加三种浓度nTiO2均不同程度地增加土壤蔗糖酶活性，分别增加15.54%、14.21%和7.75%；与对照相比，nZnO处理对蔗糖酶都表现出抑制效应，抑制率为10.59%、14.20%和11.75%。土壤脲酶活性受nSiO2和nTiO2处理影响较小，各浓度处理与对照之间的差异不显著；nZnO的添加对土壤脲酶活性产生显著的抑制效应，并随添加浓度的增加抑制效应逐渐增大，抑制率分别为17.60%、19.24%和24.52%。与对照处理相比，三种纳米材料均显著降低了土壤酸性磷酸酶的活性，随着nSiO2浓度增加，土壤酸性磷酸酶的活性也逐渐增加，但nTiO2各浓度处理间土壤酸性磷酸酶的活性差异并不显著；添加1 mg·g-1的nZnO对土壤酸性磷酸酶的活性抑制率最高为17.49%。
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图 4 三种纳米材料对水稻土壤酶活性的影响 Figure 4 Effect of three nanomaterials on enzyme activity in rice soil |
纳米材料对植物的影响不仅与添加的纳米材料的浓度有关，也与纳米材料的种类有关。王丽华[20]的研究表明，施加低浓度的nZnO对大豆植株地上部或根系干质量无明显影响，但当施加量达到3 000 mg· kg-1 nZnO时显著降低植株干质量；另外，随nAg（纳米银）施加浓度的增加，所有大豆处理的地上部分、根系干质量和总干质量均下降。梁太波等[21]研究发现，施用纳米碳均不同程度地增加了植株根系生物量。Siddiqui等[22]研究发现，用8 g·L-1的nSiO2处理番茄种子，可以提高种子发芽率、平均发芽时间、发芽指数、活力指数以及幼苗鲜质量和干质量。本研究发现低浓度的nZnO处理使水稻鲜质量和干质量增加，而高浓度的nZnO使水稻鲜质量和干质量降低，与王丽华[20]的结果相似；低、中浓度的nSiO2处理提高鲜质量和干质量与Siddiqui等[22]的结果相似。
裴福云等[23]研究发现，相比对照处理，喷施相同含硅量的纳米硅藻土、纳米二氧化硅后，苋菜干物质量分别提高43.4%和14.9%，吸收的氮磷钾总量分别提高了36%和20%。Li等[24]、李贵莲等[25]和Wang等[26]用含有nTiO2和nZnO的材料处理植株，发现其可显著增加植株根系和地上部对N、P、K元素的吸收。本研究发现nSiO2和nTiO2对水稻幼苗P和K含量的影响不显著，但nZnO显著增加植株的P含量而降低了K含量。陈丁等[27]通过nZnO和nSiO2对海水中磷酸根的吸附实验发现，nZnO可以吸附海水中的磷酸根，但nSiO2对海水中磷酸根的吸附率为0。nTiO2的电荷零点在pH 6.4左右（与水pH接近），最容易发生自聚，吸附其他离子的能力差[28]。Dimkpa等[29]于沙培条件下研究了纳米氧化锌以及相应的微颗粒氧化锌的施用在小麦植物中的归趋，运用bulk XAS技术发现，无论是施加纳米氧化锌和还是微颗粒氧化锌，其锌的形态都为磷酸锌团聚体；植物体可能通过增加体内的P含量，并与锌结合为磷酸锌团聚体，来降低纳米氧化锌对植物的毒害。植物可通过非选择性阳离子通道吸收K+，而nZnO可溶解出Zn2+，竞争性抑制植物对K+的吸收[30]，从而影响水稻对K的吸收，导致K含量降低。但与nZnO相比，nTiO2和nSiO2较难在土壤中释放出相应的离子[31-32]，因此对植物体K元素的吸收影响不显著。
3.2 纳米材料对土壤养分转化的影响本研究发现添加三种纳米化合物均降低土壤有机质含量，同时增加土壤过氧化氢酶活性。有研究表明，纳米材料可产生具有很强化学活性的氧自由基和氢氧自由基，这些自由基能与大多数有机物反应，使有机物分解成二氧化碳和水[16]，同时也会对土壤中微生物产生氧化胁迫，刺激土壤微生物生成过氧化氢酶，从而降低纳米材料对土壤微生物的氧化损伤[33]。王佳奇[34]研究发现纳米碳可以增加土壤中碱解氮、速效磷、速效钾养分的含量。李爽[35]的研究结果表明，在分蘖期喷施纳米硅制剂可以使土壤有效氮、速效磷和速效钾的含量显著提高。本研究发现nSiO2对水稻土壤中有效氮、有效磷、有效钾的含量有增加作用，与李爽[35]的研究结果相似；但nTiO2对土壤有效氮、有效磷、有效钾含量的影响并不显著；nZnO的添加降低了土壤中有效氮、有效磷、有效钾的含量，这可能是因为nZnO抑制了土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶等土壤酶活性，从而影响了土壤中养分的释放。
土壤酶活性不仅能表征土壤养分转化、运移能力和评价土壤肥力，也可作为评价纳米材料土壤污染的生物学指标。纳米材料可以通过向土壤释放金属离子改变土壤酶或其底物的空间结构，金属离子还会损伤生物体细胞进而影响土壤酶活性[36]。本研究发现nSiO2增强了土壤过氧化氢酶活性，抑制土壤酸性磷酸酶和脲酶活性。柴汉魁[31]认为nSiO2通过影响相关微生物活性进而对土壤酶活性产生影响。有研究报道，nTiO2可以提高土壤脲酶活性，抑制土壤磷酸酶活性[37]，同时，也能促进土壤抗氧化酶活性[38]。本研究也发现nTiO2显著增强了土壤过氧化氢酶和蔗糖酶活性，显著抑制了土壤酸性磷酸酶活性，nZnO抑制了土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶等土壤酶活性。Chai等[39]的研究也有类似的发现，nZnO抑制了土壤葡萄糖苷酶、脱氨酶、磷酸酶和超氧化物酶的活性。有研究认为nZnO表现毒性作用的主要原因是锌离子释放[40]，而nTiO2和nSiO2较难在土壤中释放相应的离子[31-32]，同时根据三种纳米材料的水力直径可知，nZnO的水力直径最小，nTiO2的水力直径最大，因而，nZnO表现出的毒性作用强于nSiO2，而nTiO2的毒性最弱。
4 结论（1）三种纳米材料中nZnO处理对水稻幼苗生长的影响最大，低浓度的nZnO处理对水稻生长有促进作用，中、高浓度的nZnO处理对水稻生长有显著抑制作用。低、中浓度nSiO2和中、高浓度nTiO2处理对水稻生长表现出轻微的促进作用。
（2）nZnO处理对水稻N、P、K元素吸收的影响较大，nSiO2处理对水稻N元素的吸收影响较大，nTiO2处理对水稻N、P、K元素的吸收影响均不显著。
（3）中、高浓度的nSiO2处理对土壤理化性质的影响比低浓度明显，nTiO2处理对土壤有效氮、有效磷和有效钾的影响均不显著，nZnO处理对土壤有机质、有效氮和有效钾的影响不显著。
（4）土壤酶对纳米材料比较敏感，尤其是过氧化氢酶和酸性磷酸酶的响应更为明显；三种纳米材料中nZnO对土壤酶影响最大，但其受纳米材料浓度变化的影响较小。
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