工业的迅速发展与金属矿产的开采和冶炼，导致矿区周边农田土壤重金属严重污染^[1]。据报道，我国受重金属污染耕地面积占耕地总面积20%^[2]。重金属污染的农田土壤肥力降低，农作物产量和品质下降^[3-4]，严重影响农业的可持续发展。然而，一些植物在高浓度重金属胁迫下依然能存活，这引起研究学者格外关注。有研究表明，耐性植物能在重金属胁迫下存活主要与根际微生物有关^[5-6]。微生物对寄主植物与土壤具有至关重要的作用。

丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是在自然界中广泛存在的一种微生物，与90%以上的高等陆生植物根系形成丛枝菌根共生体^[7-8]。AMF除了能改善植物根际土壤的理化性质外，还能对宿主植物的营养、水分吸收和植物生长产生促进效应。在重金属的胁迫下，AMF菌丝分泌一类特殊的糖蛋白——球囊霉素相关蛋白（Glomalin related soil protein，GRSP），能大量结合土壤中的重金属离子，改变土壤中重金属的生物有效性^[9-10]。GRSP和根外菌丝的协同作用可促进土壤团粒的形成。土壤团粒是土壤养分的储存库和各种微生物的生境^[11]，是土壤中有机碳、氮的一个主要来源，对不稳定性碳、氮具有保护作用^[12-13]。土壤团聚体的特殊结构能间接吸附土壤中有效态重金属，对有效态重金属具有固定作用^[14]，也能固定土壤中矿质养分和水分^[15-16]，改善根际土的理化性质。根际环境的状况直接影响重金属在土壤-植物系统中的迁移与转化^[17]，调节植物对重金属的吸收和转运过程，抑制植物体内重金属转移^[18]，降低重金属的毒害作用。AMF侵染植物根系后改变根表面的理化性质和根系的形态，增强植物对矿质养分的吸收，从而促进植物的生长^[19]。目前AMF协助宿主植物直接对抗重金属的毒害机制已有大量文献报道，但AMF间接影响宿主植物对重金属的耐性机理研究极为少见。AMF间接作用在其中发挥的重要作用不容忽视，因此利用AMF改善重金属污染的农田土壤、提高农作物抗性、改良农作物品质和提高产量具有重要的科研价值。

云南省会泽县位于云南省东部，是我国重要的铅锌矿产地之一，是我国铅锌矿区的典型代表^[20]。兰坪县位于云南省西北部，是亚洲最大的铅锌矿床，也是世界特大型铅锌矿床之一^[21]。两大矿区的生产与冶炼对矿区周边农田土壤造成不同程度的重金属污染^[22]，而农田土壤是人类赖以生存的重要基质，改善农田土壤性质、提升农作物品质和产量是近年来重要的任务^[23]。本文选取会泽县、兰坪县矿区周边废弃农田土壤为基质，探讨接种AMF对玉米的生长、矿质营养和重金属（镉、铅）累积的影响，旨在为农产品的增产、品质的改善以及矿区重金属污染农田土壤的修复机理研究提供数据支持。

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试玉米（Zea mays L.）为会单4号，于云南省昆明市小板桥种子市场购得，所选种子籽粒饱满且大小一致。

供试土壤为山原红壤，采自云南省会泽某铅锌矿（26°34′ 21.1″ N，103°38′ 12.9″ E）、兰坪某铅锌矿（26° 22′ 30.0″ N，99°22′ 27.6″ E）周边污染农田土壤，基本理化指标见表 1。

供试菌种AMF为摩西球囊霉菌，由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供。扩繁AMF，土壤来自会泽县者海镇玛色卡村，以玉米为宿主植物，AMF定殖于植物根系后，形成典型的特征结构，并大量增殖，使AMF菌群不断扩增。扩繁后每克土壤含20~28个孢子。

1.2 试验设计

将玉米种子放入1%次氯酸钠（NaClO）溶液中处理1 min，取出洗净后，放入75%的乙醇溶液中处理3 min，洗净后，放入垫有浸湿滤纸已灭菌的培养皿中，在25 ℃恒温培养箱中培养4 d，待种子萌发冒白芽，挑选无污染且生长一致的幼苗，备用。

土壤采回后，经自然风干，剔除杂物，捣碎研磨后过2 mm尼龙筛混匀，将土壤放入蒸汽高压灭菌锅，设置121 ℃高温灭菌120 min后^[24]，常温条件放置3 d待用。

于2018年6月9日在云南农业大学实验大棚内开始试验，试验分别选取会泽、兰坪两个地方土壤，每个地方土壤设两组处理（对照、接种AMF），每组处理4个平行，共16份盆栽。对照组（CK）：灭菌土4 kg+灭菌土40 g；接种AMF组（AMF）：灭菌土4 kg+AMF菌种40 g。每盆播种玉米苗2株，实验过程中不施用化肥和农药，采用自然光照，期间根据盆栽土壤水分状况浇灌去离子水，保持土壤湿润，培育60 d后采样。

将玉米整株取出，抖去根部附着比较疏松的土壤，采集与根系紧密结合的根际土壤（厚度约为1 mm），自然风干捣碎研磨后装袋备用。将玉米植株分为地上部茎叶和地下部根系，用无菌水漂洗干净，晾干，于105 ℃杀青30 min，再经75 ℃烘干72 h至恒质量，碾磨粉碎备用^[22]。

1.3 测定方法

植物根系侵染率测定：根系洗净后取长1 cm根段样品，将其在100 ℃、10%KOH溶液中脱色30 min至透明，用无菌水冲洗3次，将根段放入2% HCl 3~5 min后，用无菌水冲洗3~5次，用90 ℃酸性品红染色液染色30 min，挑选出较完整的根段，将其排列在载玻片上，盖上盖玻片后在电子显微镜上观察^[25]。菌丝密度的测定按照Abbott等^[26]的方法进行。

采用湿筛-倾析法测定孢子数，取土样5 g于烧杯中，加100 mL蒸馏水，顺时针搅拌2 min，静置10 min，悬浮液倒入离心管，转速2000 r·min^-1离心5 min，取上清液，加入45%蔗糖溶液，继续离心30 s，将上清液过0.45 μm滤膜，在显微镜下观察计数^[27]。

用直尺测量株高，地上部和地下部干质量用电子秤称量。采用便携式叶绿素测定仪HM-YD测定叶绿素，英国PP-System公司CIRAS-1型全自动便携式光合测定仪测定光合作用指标参数^[28]。

分别采用碱解扩散比色法、0.5 mol·L^-1 NaHCO₃浸提-钼锑抗比色法测定土壤碱解氮、速效磷的含量^[29]。

H₂SO₄-H₂O₂消煮后，分别采用凯氏定氮法和钒钼黄比色法测定植株全氮和全磷的含量。HNO₃-HClO₄消煮后，采用火焰原子吸收分光光度法测定植物镉和铅的含量。0.1 mol·L^-1 HCl浸提后，采用火焰原子分光光度法测定土壤有效态镉和铅的含量^[30]。

土壤总球囊霉素相关蛋白（Total glomalin related soil protein，T-GRSP）和易提取球囊霉素相关蛋白（Easily extractive glomalin related soil protein，EEGRSP）含量测定方法：取1.0 g风干土样, 分别用20 mmol·L^-1柠檬酸缓冲液（pH 7.0）提取30 min或者50 mmol·L^-1柠檬酸钠缓冲液（pH 8.0）提取60 min，提取条件为0.11 MPa、121 ℃，然后10 000 r·min^-1离心5 min，分别得到EE-GRSP和T-GRSP的待测液，采用Braford法测定上清液中GRSP的含量^[31]。

1.4 统计分析

试验数据运用Microsoft Excel 2013对数据进行处理，计算平均值和标准差，用IBM SPSS Statistics V21.0数据处理软件进行统计分析，用Duncan法检验各处理平均值在0.05水平的差异性，用OriginPro 9.0进行绘图。

2 结果与分析 2.1 接种AMF菌根侵染特征

经检测，接种AMF处理的会泽和兰坪土壤中玉米根系侵染率分别为35.23%和25.42%，菌丝密度分别为40.16 cm·g^-1和28.36 cm·g^-1，孢子数分别为26.72个·g^-1和18.82个·g^-1。

由图 1可知，两种土壤接种AMF后土壤球囊霉素相关蛋白含量显著增加，会泽和兰坪土壤易提取球囊霉素相关蛋白含量分别增加77.9%和45.2%，总球囊霉素相关蛋白含量分别增加75.1%和88.8%。说明接种AMF能增加土壤球囊霉素相关蛋白含量。

2.2 接种AMF对玉米植株光合生理和生长的影响

由表 2可见，会泽和兰坪两种土壤接种AMF后玉米叶片光合生理均显著增加，增加的程度各有差异，其中会泽土壤玉米叶片叶绿素含量、光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO₂浓度分别增加60.8%、1.55倍、4.00倍、89.1%和33.9%；兰坪土壤玉米叶片叶绿素含量、光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO₂浓度增幅分别为12.1%、69.8%、1.00倍、24.3%和1.34倍。说明接种AMF能不同程度增加玉米叶片光合生理指标。

由表 3可见，会泽土壤接种AMF处理玉米地上部、地下部的生物量和株高均显著提高，地上部分别增加1.17倍和39.1%；地下部分别增加1.15倍和61.9%。兰坪土壤接种AMF处理玉米地上部生物量和株高显著增加，增幅分别为36.2%和12.8%，但对地下部生物量和株高没有显著影响（P>0.05）。说明接种AMF能增加玉米地上部的生物量和株高。

2.3 接种AMF对土壤-玉米体系养分含量的影响

由表 4可知，两种土壤接种AMF处理土壤碱解氮和速效磷含量均显著增加，会泽土壤碱解氮和速效磷含量分别增加63.8%和2.06倍，兰坪土壤碱解氮和速效磷含量分别增加30.9%和92.8%。说明土壤接种AMF能增加土壤速效养分含量。

两种土壤接种AMF处理玉米养分含量均显著升高，会泽玉米地上部、地下部的全氮和全磷含量分别增加30.3%、34.6%和17.6%、35.7%；兰坪玉米地上部全氮含量增加33.3%，但地下部全氮含量无显著差异（P>0.05），地上部和地下部全磷含量分别增加38.5%和32%（表 4）。说明接种AMF能增加玉米植株养分含量。

2.4 接种AMF对土壤有效态镉、铅含量的影响

两种土壤接种AMF后土壤中有效态镉、铅含量均显著降低，会泽土壤有效态镉、铅含量分别降低79.5%和36.6%，兰坪土壤有效态镉、铅含量分别降低75.7%和34.6%（图 2）。说明接种AMF能降低土壤中有效态重金属含量。

2.5 接种AMF对玉米植株镉、铅含量和累积量的影响

由表 5可知，两种土壤接种AMF后玉米中镉、铅含量均显著降低，会泽土壤地上部和地下部镉、铅含量分别降低32.9%和58.1%、30.0%和41.6%，兰坪土壤地上部和地下部镉、铅含量分别降低45%和40%、68.7%和62.6%。

会泽土壤接种AMF处理玉米镉、铅元素地下部向地上部的转运系数显著增加；兰坪土壤接种AMF处理玉米铅元素地下部向地上部的转运系数显著降低，但镉元素的转运系数没有显著差异（P>0.05）

由表 6可知，两种土壤接种AMF后，会泽土壤玉米地上部镉和铅累积量显著增加，分别增加45.4%和52.1%。兰坪土壤地上部、地下部的镉和铅累积量显著降低，分别降低25%、30.6%和57.2%、56.9%。重金属污染土壤接种AMF对玉米地上部、地下部的镉、铅积累量会表现出抑制、无影响和促进等不同效应。

2.6 相关性分析

由表 7~表 9可看出，EE-GRSP与土壤有效态铅呈显著负相关，T-GRSP与土壤有效态铅呈显著负相关，与土壤碱解氮、速效磷呈极显著正相关。玉米镉含量与土壤有效态镉呈显著正相关，玉米铅含量与土壤有效态铅呈显著正相关。玉米地下部全氮与土壤碱解氮呈显著正相关，与土壤速效磷呈显著正相关。玉米全磷含量与土壤速效磷呈显著正相关。

3 讨论

GRSP是AMF代谢分泌的一类糖蛋白^[32-33]，能与土壤中重金属结合，改变重金属的生物有效性。目前GRSP在土壤生态系统中的生态学功能以及生态学地位受到学者们的重视。有学者研究表明，GRSP能固定土壤中镉、铅等重金属离子，改变重金属离子在土壤中的生物有效性^[34]，且固定量与总量成正相关，反之GRSP与土壤有效态重金属含量成负相关。与本研究在重金属胁迫下，接种AMF土壤T-GRSP和EE-GRSP含量高于对照处理的土壤，土壤有效态重金属镉、铅含量显著降低，土壤T-GRSP和EE-GRSP含量与土壤重金属镉、铅含量呈显著负相关的结果相对应。目前GRSP的结构还未完全确定，最初有学者研究发现可能由于GRSP含有芳香烃、羟基等不稳定活性官能团^[35]，通过离子交换吸附-配合-共沉淀的作用，促使土壤中的重金属由离子态向残渣态转变，从而降低土壤中重金属的生物有效态；之后有学者研究表明可能由于GRSP中不稳定的金属阳离子被土壤中的活性重金属阳离子取代，从而被固定在土壤中^[36-37]。总之，GRSP能改变土壤中重金属生物有效性，且能将重金属固定在土壤中，具体原因还有待深入探讨。

在重金属的胁迫下，丛枝菌根结构不仅可以通过提高作物对磷元素的吸收增加作物体内叶绿素含量、促进光合作用、增强农作物抵抗重金属毒害的能力^[38]，还可以通过固氮、溶磷作用增加植物氮营养以及对土壤中不溶性磷的转化与吸收，进而促进作物生长，提高生物量。作物生长离不开光合作用，叶绿素是作物进行光合作用的重要色素因子，光合速率、胞间CO₂浓度、蒸腾速率和气孔导度是影响光合作用的重要因素^[39]。叶片叶绿素的含量直接影响植物光合作用的强弱与生长状况，但重金属胁迫下，植物吸收大量的重金属会破坏叶绿素的结构，使光合作用受到抑制^[40-41]，进而抑制植物生长。本研究结果表明，重金属胁迫下接种AMF能显著提高玉米叶片叶绿素的含量，增加光合速率、气孔导度、蒸腾速率和胞间CO₂浓度。这可能由于丛枝菌根共生体扩大了寄主植物根吸收面积，加速根系生长，提高对移动性低的氮磷元素的吸收^[42]，从而提高光合速率，促进生物的生长，增加生物量^[15]。

AMF具有较强的重金属络合能力，能通过表面的吸附作用以及菌丝产生GRSP的结合作用降低重金属对植物的毒性。AMF侵染可增加植物根细胞中的金属螯合态PCs-多聚甘氨酸含量，能将植物中的重金属结合在根部，从而抑制重金属向植物地上部转运，进而降低重金属的生理毒害^[43]。AMF可以通过菌丝对重金属的过滤以及真菌细胞壁分泌的黏液和组织中的聚磷酸盐、有机酸等络合作用^[44]，避免重金属对植物组织造成伤害，此过程统称为过滤机制。接种AMF能降低植物中重金属含量，但对植物中重金属累积量的影响会表现出抑制、无影响和促进等不同效应，对翅荚木^[45]重金属的累积量表现促进效应，对紫花苜蓿^[46]地上部累积量表现抑制作用。本研究结果表明，重金属胁迫下，接种AMF玉米地上部和地下部镉、铅含量显著降低，会泽矿区土壤玉米地上部镉、铅累积量均显著增加，兰坪矿区玉米地上部和地下部镉、铅累积量均显著降低；会泽矿区土壤玉米地下部向地上部镉、铅转运系数均显著增加，且镉转运系数大于铅转运系数；兰坪矿区土壤玉米地下部向地上部铅转运系数显著降低，而镉转运系数小于铅转运系数。有学者对一些作物研究发现，AMF能提高牡丹的叶绿素、可溶性蛋白质、矿质元素（氮、磷、钾）含量，提高生物量，促进牡丹生长^[47]。AMF可以通过提高花生对磷元素的吸收来增加植株体内叶绿素含量及改善光合作用，增强花生抗Cd毒害的能力，进而促进花生生长，提高植株生物量^[38]。与本试验重金属胁迫下，接种AMF玉米养分（全氮、全磷）含量显著增加，生物量与产量上升，且EE-GRSP与玉米全氮呈显著正相关，T-GRSP与玉米全磷呈显著正相关的结果相一致。本研究发现接种AMF后两个矿区土壤部分理化性质、玉米生长和镉铅含量、累积量等结果存在差异，可能由于两个矿区的土壤理化性质与重金属污染程度不同，具体原因还需深入研究。AMF对不同类型的污染土壤作用效果也需大量的试验进行研究。

4 结论

重金属胁迫下，会泽、兰坪两种土壤接种AMF都能促进AMF分泌GRSP次生代谢产物，降低土壤中有效态镉、铅含量，减少玉米对重金属的吸收，促进玉米叶片的光合作用以及玉米对养分（氮、磷）的吸收，提高生物量。