2020, Vol. 37
2. 农业农村部桂林作物有害生物科学观测实验站, 广西 桂林 541399
2. Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Guilin, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guilin 541399, China
氟吡菌胺（Fluopicolide），化学式为2，6-二氯-N-（[3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶基）甲基]苯[1]，是德国拜耳作物科技有限公司开发的一种新型苯甲酰胺类杀菌剂，主要用于防治卵菌纲病原菌引起的植物病害，如疫病、霜霉病、晚疫病等[2]，目前我国已在黄瓜、大白菜、番茄等作物上登记使用。氟吡菌胺具有独特的作用方式，主要对细胞膜和细胞间的特异性蛋白表现杀菌活性，且与其他类杀菌剂无交互抗性[3]，因而被广泛使用。联合国粮农组织/世界卫生组织农药残留专家联席会议指出，氟吡菌胺的代谢物2，6-二氯苯甲酰胺的急性和长期毒性高于氟吡菌胺。2，6-二氯苯甲酰胺的每日允许摄入量（ADI）为0.02 mg·kg-1，氟吡菌胺的每日允许摄入量为0.08 mg·kg-1[4]。因此对氟吡菌胺及其代谢物的检测具有同等重要的意义。
最高残留限量是由国际组织和政府制定的，以保护公众健康安全不受农药的有害影响。联合国粮农组织、欧盟、美国和加拿大已确定黄瓜中氟吡菌胺的最大残留限量为0.5 mg·kg-1[5]。目前，我国规定的氟吡菌胺在黄瓜中的最大残留限量为0.5 mg·kg-1（GB 2763—2016）。
目前已报道的检测作物和环境介质中残留农药的方法包括气相色谱-质谱法[6]、气相色谱法[7]、液相色谱-质谱法[8]、高效液相色谱法[9]。关于氟吡菌胺的研究主要集中在其对不同作物的杀菌活性，如南瓜[10]、烟草[11]。而关于同时测定氟吡菌胺及其代谢物的研究方法较少。Shi等[5]建立了用气相色谱电子捕获检测器（GC-ECD）同时测定黄瓜中氟吡菌胺及其代谢物的方法。Manikrao等[12]建立了利用气相色谱-质谱法（GC-MS）分析甘蓝和土壤中氟吡菌胺及其代谢物2，6-二氯苯甲酰胺的方法。但以上两种方法均使用气相色谱，存在处理复杂、耗时长、有机溶剂损耗多的缺点。本研究首次建立了一种快速、简便、灵敏、安全、高效的液相色谱串联质谱分析方法，可同时测定黄瓜中氟吡菌胺及其代谢物2，6-二氯苯甲酰胺的残留。通过评估田间条件下氟吡菌胺及其代谢物在黄瓜上的残留水平，为氟吡菌胺的正确、安全使用提供指导。
1 材料与方法 1.1 仪器和试剂高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪（Agilent 6470）；KQ500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FZ102微型组织粉碎机（天津泰斯特公司）；CK-1000组织振荡混合仪（北京托摩根生物有限公司）；TG16-WS型台式高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；XW-80A型漩涡混合器（美国Scientific industries公司）；Filter Unit型有机滤膜（0.22 μm，Agela Technologies公司）。
氟吡菌胺标准品（99.3%）、2，6-二氯苯甲酰胺标准品（99.0%）均由北京勤诚亦信科技有限公司提供。乙腈为分析纯（北京化学试剂公司）；正己烷、甲醇为色谱纯（康科德有限公司）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；无水MgSO4、NaCl均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
准确称取一定量的氟吡菌胺、2，6-二氯苯甲酰胺标准品，依次用乙腈做溶剂配制100 mg·L-1的储备液100 mL，而后用乙腈稀释梯度为10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 mg·L-1的系列标准品混合溶液。
1.2 田间试验残留试验参照《农作物中农药残留试验准则》（NY/T 788—2018）进行设计。选取12个试验地点，分别是吉林长春市、内蒙古赤峰市、陕西杨凌区、贵州贵阳市、广西南宁市、河南济源市、北京通州区、安徽萧县、湖南长沙县、山东潍坊市（露地）、山东潍坊市（大棚）、浙江杭州市。每个田间试验包括1个试验小区和1个对照小区，每小区面积至少50 m2，且小区之间设立缓冲带。于黄瓜收获前14 d喷雾施药，按照施药剂量70 g·667 m-2（有效成分735 g·hm–2），3次施药处理，施药间隔期为7 d，施药方式为兑水喷雾，每667 m2兑水50 L，于最后一次施药后1、3 d和5 d采集黄瓜样品。采用随机法采样，每个小区从不少于12株黄瓜植株上采集不少于12个果实，每个样品质量不低于2 kg，每个样品至少制备2份样品（1份用于检测，一份试验结束后至少保存半年）。田间样本在采集后8 h内运回实验室，制样冷冻保存。黄瓜样品经粉碎后，按四分法缩分取300 g保存待测。无法立即检测的样品，低于-18 ℃条件下冷库储藏。
1.3 样品前处理称取均质的黄瓜样品2.0 g于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，2000 r·min-1振荡5 min后，加入1 g NaCl，2000 r·min-1振荡3 min，在4000 r·min-1离心5 min，取1.5 mL上清液，加入含有150 mg无水MgSO4、50 mg PSA（乙二胺-N-丙基硅烷）和20 mg GCB（石墨化碳）的2 mL离心管中，涡旋1 min，在5000 r·min-1离心5 min，取1 mL上清液过0.22 μm有机滤膜，待进样。
1.4 液相色谱与质谱条件色谱条件：流动相为甲醇（A相）和超纯水（B相）；流速0.4 mL·min-1；进样量5 μL。进样梯度：0~1.5 min，10%~90% A；1.5~2.0 min，90% A；2.0~2.1 min，90%~10% A；2.1~5.0 min，10% A。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；干燥气温325 ℃；干燥气流速10 L·min-1；毛细管电压4000 V；电喷雾压力35 psi（1 psi=6.895 kPa）；多反应监测（MRM）模式下氟吡菌胺和2，6-二氯苯甲酰胺的质谱参数见表 1。
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表 1 多反应监测模式下氟吡菌胺和2，6-二氯苯甲酰胺的质谱参数 Table 1 Mass spectrometry parameters of fluopicolide and 2, 6-dichlorobenzamide in multi-reaction monitoring(MRM) |
黄瓜等植物源农产品样品的提取液中含有脂肪酸、甾醇、色素和糖类等杂质，需选取不同种类的净化剂进行去除[13]。研究对比了不同净化材料处理对回收率的影响，T1为150 mg无水MgSO4+50 mg PSA，T2为150 mg无水MgSO4+50 mg PSA+10 mg GCB，T3为150 mg无水MgSO4+50 mg PSA+20 mg GCB。3种处理方式对3种农药的回收率见图 1。结果表明，在T2处理条件下回收率最低，为62.98%~87.73%，T3处理条件下回收率最高，为94.13%~95.63%。最终确定150 mg无水MgSO4+50 mg PSA+20 mg GCB为黄瓜样品提取液的净化剂。
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图 1 不同净化剂对氟吡菌胺和2，6-二氯苯甲酰胺回收率的影响（n=5） Figure 1 Effect of different purification treatments on pesticide recovery(n=5) |
经测定，氟吡菌胺和2，6-二氯苯甲酰胺的标准曲线回归方程分别为y=51 888x+1 174.5（R2=0.994 5）；y=226 260x+2 289.4（R2=0.998 5），在0.01~1 mg·kg-1范围内线性关系良好。由氟吡菌胺和2，6-二氯苯甲酰胺标准品的MRM色谱图（图 2）可知，其保留时间分别为1.697 min和2.371 min。Manikrao等[12]建立的气相色谱-质谱法（GC-MS）中，氟吡菌胺和2，6-二氯苯甲酰胺的保留时间分别为35.9 min和21.4 min。Paramasivam等[14]采用气相色谱-质谱法检测葡萄中的氟吡菌胺时，氟吡菌胺的保留时间为12.8 min。因此本实验方法可以大大缩短分析所需时间，为测定氟吡菌胺及其代谢物在黄瓜中的最终残留水平指供方法借鉴。
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图 2 氟吡菌胺和2，6-二氯苯甲酰胺0.5 mg·kg-1标准品色谱图 Figure 2 Chromatogram of fluopicolide and 2, 6-dichlorobenzamide in cucumber(0.5 mg·kg-1) |
加标回收试验结果显示，在0.05~5 mg·kg-1加标范围内，黄瓜样品中氟吡菌胺平均回收率为82%~ 98%，相对标准偏差（RSD，n=5）为1.6%~7.9%（表 2），2，6-二氯苯甲酰胺平均回收率为90%~100%，相对标准偏差（RSD，n=5）为3.2%~9.4%（表 3），该方法的重复性、精密度及准确度均满足氟吡菌胺、2，6-二氯苯甲酰胺残留分析的要求。
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表 2 氟吡菌胺在黄瓜中加标回收率及相对标准偏差 Table 2 Recovery and relative standard deviation(RSD) of fluopicolide in cucumber |
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表 3 2，6-二氯苯甲酰胺在黄瓜中加标回收率及相对标准偏差 Table 3 Recovery and relative standard deviation(RSD) of 2, 6-dichlorobenzamide in cucumber |
氟吡菌胺和2，6-二氯苯甲酰胺在12个试验地点的最终残留量见表 4。在氟吡菌胺最大推荐剂量（735 g·hm–2）下，施药3次，距最后一次施药间隔1、3 d和5 d采收，氟吡菌胺、2，6-二氯苯甲酰胺在黄瓜中残留均未检出（定量检出限0.05 mg·kg-1），即残留量均低于国家标准规定的氟吡菌胺在黄瓜中的最大残留限量0.5 mg·kg-1（GB 2763—2016）。由表 4可以看出，距最后一次施药间隔1、3、5 d采收，氟吡菌胺、2，6-二氯苯甲酰胺在黄瓜中的残留量总和均小于0.05 mg·kg-1，符合联合国粮农组织/世界卫生组织农药残留专家联席会议提出的氟吡菌胺在动植物商品中的残留量标准。
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表 4 黄瓜中氟吡菌胺和2，6-二氯苯甲酰胺的最终残留量（mg·kg-1） Table 4 Summary of final residue of fluopicolide and 2, 6-dichlorobenzamide in cucumber(mg·kg-1) |
（1）首次建立了QuEChERS前处理方法联合液相色谱串联质谱同时测定黄瓜中氟吡菌胺及其代谢物（2，6-二氯苯甲酰胺）的高效分析方法。该方法前处理过程简便、快速，结果重复性、精密度及准确度均能达到残留分析要求。
（2）田间实际样品检测结果表明，氟吡菌胺在最大推荐剂量下（735 g·hm–2）施药3次，距最后一次施药间隔1、3 d和5 d时采收，氟吡菌胺及2，6-二氯苯甲酰胺在黄瓜中的残留量均低于国家标准规定的氟吡菌胺在黄瓜中的最大残留限量。本研究为氟吡菌胺及其代谢物在黄瓜上的安全性评价提供技术支撑。
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