丹江口水源涵养区生态环境脆弱，80%以上土地属于土石山区和丘陵沟壑区^[1]。十堰市地处秦巴山区腹地，猕猴桃野生资源极其丰富，该地区土壤肥沃、雨量充沛、光照充足，是我国适宜猕猴桃生长的主要地区之一。截至2011年底，全市人工种植猕猴桃面积约70 hm²，年产猕猴桃近80万kg^[2]。因地制宜发展猕猴桃产业，既能保护库区生态环境，又能增加山区农民收入，提高农业综合生产能力。但是，目前在猕猴桃的生产过程中仍以传统的清耕制管理模式为主，导致土壤退化、养分流失、环境污染等一系列生态环境问题。

果园中种植覆盖作物是一种现代化果园土壤管理模式，在防止水土流失^[3-4]、增加土壤养分^[5-7]、提高土壤生物活性^[8-10]等方面具有重要的作用。黑麦草（Lolium perenne L.）作为世界上种植最广泛的冷季型牧草之一，具有适应性广、覆盖面积大、生长速度快、再生性强、产量高等优点^[11]。白三叶（Trifolium repens L.）为多年生豆科优质牧草，具有适应性广、产量高、竞争力强、持久性好等优点，其根瘤能够固定大气中的氮，为宿主植物提供氮素，从而减少氮肥的投入^[12]。在果园覆盖管理过程中，黑麦草和白三叶是2种常用的牧草，果园中种植黑麦草可以增加土壤微生物数量，提高土壤微生物活性，促进微生物对有机质的分解^[13]；间作白三叶能够显著增加土壤微生物生物量碳、氮含量，提高土壤微生物对碳源的利用能力及多样性^[14-15]。然而二者混合种植对土壤微生物群落结构的影响研究较少。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，影响土壤中物质循环、能量流动及有机物质分解^[16-17]。同时，土壤微生物对土壤环境变化非常敏感，可以用来评价土壤管理措施对土壤质量的影响^[18-19]。因此对土壤微生物群落结构的研究成为当前研究的热点。本研究在猕猴桃园间作系统下，研究黑麦草和白三叶混合种植对土壤微生物群落结构的影响，旨在探讨猕猴桃园土壤微生物群落结构对覆盖作物的响应，为丹江口水源涵养区果园生态管理模式的探索提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验地概况

试验地位于湖北省十堰市农业科学院柳陂基地（32°50′N，110°60′E），属北亚热带季风气候，年均温度16 ℃，年均降雨量950 mm，平均海拔220 m，无霜期248 d。猕猴桃园土壤本底基本理化性质：有机质6.67 g·kg^-1，全氮0.44 g·kg^-1，全磷0.49 g·kg^-1，pH为8.14^[20]。

1.2 试验设计

本试验于猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）园进行，2015年春季开始种植猕猴桃树，株行距为3 m×5 m，于2016年9月开始种植覆盖作物。试验共设置3个处理，分别为：种植覆盖作物+覆盖作物刈割后留在土壤表面自然腐解（T1）、种植覆盖作物+覆盖作物刈割后从园中清除（T2）和清耕对照（CK），每处理重复3次，共9个小区，各小区随机排列，每小区面积20 m×2 m。播前深翻整地，同时施用化肥（N-K₂O-P₂O₅，15%- 15%-15%）300 kg·hm^-2。播种密度为黑麦草150 kg· hm^-2、白三叶100 kg·hm^-2。在2018年5月、7月对覆盖作物进行刈割，刈割后按照试验设计将T1处理中覆盖作物留在土壤表面自然腐解，T2处理中覆盖作物从园中移除，清耕区定期进行人工除草。各处理区的生态条件和田间管理措施保持一致。

1.3 样品采集

2018年8月采集土壤样品，采用“S”型取样法，每个小区随机选取10个点，用直径为3 cm土钻取土，取0~20 cm土壤样品，剔除石块、植物残根等杂物后，将同一小区土壤样品混合均匀后装入无菌袋内，置于冰盒中带回实验室，一部分-80 ℃冰箱中保存，用于土壤微生物群落结构分析；一部分于室内自然风干后研磨过筛，用于土壤理化性状分析。

1.4 测定方法 1.4.1 土壤微生物群落结构的测定

土壤微生物采用磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）法测定^[21]。首先，用单相氯仿-甲醇-柠檬酸缓冲液（体积比1:2:0.8）提取3 g冻干土壤样品的总脂，分别用氯仿、丙酮和无水甲醇洗脱，经水解和皂化得磷脂脂肪酸甲酯，加入十九烷酸甲酯（19:0）用气相色谱质谱法对样品进行磷脂脂肪酸的鉴定，并利用内部标准（19:0 nonadecanoic methyl ester）将峰值面积转化为每克土壤中磷脂脂肪酸含量，以每克干土中测定的磷脂脂肪酸的总和作为总PLFA量（PLFAs），以12:0、15:0、16:0、17:0、18:0、a15:0、a17:0、i14:0、i16:0、i17:0、i19:0、18:1ω10、18:1ω11、cy17:0、cy19:0、16:1ω9c、16:1ω7c、17:1ω7c、18:1ω9t、20:1ω9c、i17: 1ω5c表征细菌，其中a15:0、a17:0、i14:0、i16:0、i17:0、i19:0属于革兰氏阳性菌，cy17:0、cy19:0、16:1ω9c、16:1ω7c、17:1ω7c、18:1ω9t、20:1ω9c、i17:1ω5c属于革兰氏阴性菌；真菌用18:1ω9c、18:2ω6，9来表征；放线菌用10Me18:0、10Me19:0来表征^[22-23]。然后计算革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌和真菌/细菌。

1.4.2 土壤理化性质及微生物量碳、氮的测定

土壤有机碳用重铬酸钾外加热方法测定；土壤pH采用玻璃电极法（水土比2.5:1）测定；土壤含水量采用烘干法进行测定，105 ℃烘24 h后称质量得到质量含水量；土壤全氮采用全自动连续流动分析仪（AA3，Bran+Luebbe Corp.）测定^[24]；微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸，硫酸钾浸提，TOC自动分析仪测定^[25]。

1.5 数据处理

采用单因素方差分析（One-way ANOVA）对不同处理下土壤理化性质，微生物量碳、氮及微生物各类群PLFAs量进行分析，利用主成分分析（PCA）检验土壤微生物群落结构的差异，冗余分析（RDA）及Pear⁃ son相关分析检验土壤环境因子与微生物类群之间的相关性。所有方差分析及Pearson相关分析均在统计分析软件SPSS 22.0中进行，主成分分析和冗余分析在多元统计分析软件Canoco for Windows 5.0中进行。

2 结果与分析 2.1 覆盖作物对土壤理化性质及微生物量碳、氮的影响

由表 1可知，T2处理土壤含水量低于T1和CK处理（P < 0.05），T1处理土壤含水量与CK无显著差异。T1和T2处理土壤pH值高于CK处理（P < 0.05）。T1处理土壤总氮含量显著高于T2和CK（P < 0.05），C/N显著低于T2和CK（P < 0.05）。T1和T2处理土壤有机碳含量与CK无显著差异。T1和T2处理均显著增加了土壤微生物量碳、氮含量（P < 0.05），但是T1和T2处理间无显著差异。

2.2 覆盖作物对土壤微生物群落特征的影响

PLFAs分析结果（表 2）显示，覆盖作物处理影响土壤PLFAs含量。覆盖作物处理显著增加土壤微生物PLFAs总量，T1和T2处理土壤微生物PLFAs总量分别高于CK 13.63%、13.02%（P < 0.05），但T1与T2处理间无显著差异。T2处理土壤真菌PLFAs量显著高于CK 85.71%（P < 0.05），T1处理与CK无显著差异。T1处理土壤革兰氏阴性菌PLFAs量显著高于CK 51.27%（P < 0.05），T2处理与CK无显著差异。T1处理降低了革兰氏阳性菌PLFAs量/革兰氏阴性菌PLFAs量（P < 0.05），T2处理与CK无显著差异。

2.3 覆盖作物对土壤微生物群落结构的影响

对不同处理土壤微生物群落进行主成分分析，结果（图 1）表明，主成分1和主成分2的方差贡献率为67.53%。主成分分析中T1处理与CK的主成分分析图更为接近，说明T1处理与CK处理的微生物群落结构相似度更高，而T2处理的土壤微生物群落有明显的分区。CK与T1处理下土壤微生物的优势类群为12:0、18:1ω10、16:0、14:1ω1、16:1ω9c、i17:1ω5c、18: 1ω9t、18:2ω6，9；T2处理下土壤微生物的优势类群为18:2ω10、18:1ω9c、cy17:0、15:0、17:0、i16:0。

2.4 土壤环境因子与土壤微生物群落特征的相关性

土壤环境因子与土壤微生物群落Pearson相关性分析结果（表 3）表明，pH与土壤微生物PLFAs总量呈极显著正相关（P < 0.01），与细菌PLFAs量、革兰氏阴性菌PLFAs量呈显著正相关（P < 0.05）；碳氮比与革兰氏阴性菌PLFAs量呈显著负相关（P < 0.05），与革兰氏阳性菌PLFAs量/革兰氏阴性菌PLFAs量呈极显著正相关（P < 0.01）；总氮与革兰氏阴性菌PLFAs量呈极显著正相关（P < 0.01），与革兰氏阳性菌PLFAs量/革兰氏阴性菌PLFAs量呈显著负相关（P < 0.05）；土壤含水量与真菌PLFAs量/细菌PLFAs量呈显著负相关（P < 0.05）。同时对土壤环境因子（含水量、总氮、有机碳、碳氮比、pH）与不同处理土壤微生物群落进行冗余分析，结果（图 2）表明，第1和第2排序轴分别解释了土壤微生物群落结构总体变异的44.71%和32.39%，其中土壤pH（F=4，P=0.018）、碳氮比（F=4，P=0.028）是影响土壤微生物群落的主要环境因子。

3 讨论

猕猴桃园种植覆盖作物可增加园中土壤的覆盖度，减少地表土壤水分的蒸散，提高土壤水分含量^[26-27]；同时覆盖作物刈割物还田、根系分泌物等可以将养分返还到土壤中，从而增加土壤中养分含量，调节土壤酸碱度，有利于土壤有机质的形成^{[26, 28]}。本研究结果表明，猕猴桃园种植覆盖作物无论是将覆盖作物刈割后留在土壤表面（T1）还是从园中清除（T2），均显著提高土壤pH值。此外，覆盖作物刈割后留在土壤表面还可以显著提高土壤总氮含量，这与李惠等^[29]、王耀锋等^[26]、郭磊等^[30]的研究结果相似。说明猕猴桃园间作覆盖作物对土壤质量的改善和肥力的提升有一定的促进作用。

土壤微生物量促进植物养分转化和循环，是评价生态系统稳定及土壤质量的重要指标^[31-32]。研究土壤微生物量碳氮对了解土壤肥力、土壤养分的转化和循环具有重要意义^[33-34]。本研究结果表明，覆盖作物处理可以显著提高土壤微生物量碳、氮含量，这与张道勇等^[33]、惠竹梅等^[35]的研究结果一致。土壤微生物总量增加表明了土壤肥力的提高^[36]，土壤微生物类群及种类比例的变化对土壤肥力的形成和养分的供应具有明显的调节作用^[36]。本研究结果表明，猕猴桃园覆盖作物处理显著提高土壤微生物PLFAs总量，果园中种植覆盖作物后土壤理化性状发生改变，为土壤微生物提供了适宜的生存环境，覆盖作物残体和根系分泌物为土壤微生物提供了物质和能量，促进土壤微生物的生长繁殖，增加土壤微生物量，促进土壤碳氮的累积。T1处理土壤革兰氏阴性菌PLFAs量显著提高，覆盖作物残体的输入有利于革兰氏阴性菌的生长，说明土壤革兰氏阴性菌对覆盖作物有机残体的输入反应更敏感，较革兰氏阳性菌更具有竞争优势，在整个土壤细菌群落组成中占据主导地位^[37]；T2处理土壤真菌PLFAs量显著增加，这与罗达等^[38]的研究结果相似，在森林生态系统中，去除枯落物可显著增加土壤真菌PLFAs量。主成分分析表明不同处理下土壤微生物群落结构差异显著，T1处理土壤微生物PLFAs优势类群为12:0、18:1ω10、16:0、14:1ω1、16:1ω9c、i17:1ω5c、18:1ω9t、18:2ω6，9，T2处理土壤微生物PLFAs优势类群为18:2ω10、18:1ω9c、cy17:0、15:0、17:0、i16:0。

土壤微生物群落结构主要指土壤中各主要微生物类群在土壤中的数量及各类群在微生物总量中所占的比率^[39]。作为影响土壤微生物群落组成的的重要因素，土壤pH对土壤微生物群落结构的影响较为复杂，微生物的类群不同，适合其生长的pH也不同，细菌在微碱性土壤中生长较为旺盛，而真菌在酸性条件下生长比较旺盛^[39-42]。覆盖作物有机残体的输入为土壤微生物提供了大量的碳源，促进土壤微生物对氮素的固持^[43]，调节土壤碳氮比，进而影响土壤微生物群落组成^[44]。本研究中，土壤微生物PLFAs总量、细菌PLFAs量与土壤pH呈显著正相关；革兰氏阴性菌PLFAs量与pH、总氮呈显著正相关，与碳氮比呈显著负相关；革兰氏阳性菌PLFAs量/革兰氏阴性菌PLFAs量与碳氮比呈显著正相关，与总氮呈显著负相关。土壤微生物参与土壤中养分循环，覆盖作物的加入影响土壤养分和环境因子，为土壤微生物提供物质和适宜的生存空间，促进土壤微生物的繁殖生长^[45]。

4 结论

（1）在猕猴桃园间作系统下，覆盖作物处理（黑麦草和白三叶混合种植）能够提高土壤微生物PLFAs总量及微生物量碳、氮，改变土壤微生物群落结构。

（2）覆盖作物能够通过改变土壤环境因子（主要为pH、碳氮比）来影响土壤微生物的群落结构特征。