南水北调工程是实现我国水资源优化配置、促进经济社会可持续发展、保障和改善民生的战略性基础设施。丹江口水源涵养区是南水北调中线工程核心水源区、国家级生态示范区和鄂西北国家级重点生态功能保障区，也是秦巴山区集中连片特困地区。丹江口水源涵养区水土流失面积占土地总面积的42.1%。自2014年开始，丹江口水源涵养区实施退耕还草工程，大面积退耕种植紫花苜蓿（Medicago sativa），成为国家在丹江口水源涵养区生态建设的重要举措之一。

退耕还草改变土壤生态环境^[1]，其中一个重要过程就是土壤线虫群落结构分异及动态变化^[2]。土壤线虫是土壤中最丰富的后生动物，具有较高的生物多样性，占据土壤食物网中心位置，一般作为土壤生态系统变化的敏感性指示生物；土壤线虫在土壤有机质分解、植物营养的矿化、养分循环、能量流动以及维持生态系统稳定等方面具有重要的作用^[3-7]。土壤线虫群落对不同的土地利用方式和植被恢复措施有不同的响应^[8-10]，种植苜蓿能明显改善中度退化草地土壤线虫群落结构^[11]。对丹江口水源涵养区退耕还草的研究以往大多集中在水土保持、养分流失等方面^[12-14]，而关于退耕还草土壤线虫群落变化特征鲜见报道。因此本研究从不同土地利用方式角度着手，探讨玉米田转变成紫花苜蓿人工草地后对土壤线虫群落的影响，以期解释退耕还草土壤线虫群落变化特征，从而为全面分析和预测丹江口水源涵养区土壤生态效应、保护生物多样性、有效提升区域水源涵养能力、调整和优化农业生产结构、推进农业可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 研究区域概况及试验设计

试验区位于湖北省十堰市郧阳区，地处110°07′~ 111°16′E，32°25′~33°16′N，属于北亚热带大陆性季风气候，年均气温15.4℃，年平均降水量769.6 mm，无霜期244~255 d。土壤类型为黄棕壤。该地区从2014年开始实施退耕还草，为探讨玉米田转变成紫花苜蓿人工草地后对土壤线虫群落的影响，在丹江口水源涵养区上游设置三个取样区：选取坡向、坡位基本相同的三块紫花苜蓿草地为退耕代表样地（间隔大于1 km，退耕前均长期种植玉米），且选取相邻未退耕的玉米田为对照（间隔小于10 m）。退耕还草样地基本情况见表 1。紫花苜蓿地和玉米田均按常规方式管理：紫花苜蓿年刈割4次，玉米（Zea mays）收获后秸秆不还田；紫花苜蓿地施肥量为120 kg N·hm^-2、75.0 kg P₂O₅·hm^-2；玉米田施肥量为315 kg N·hm^-2、100 kg P₂O₅·hm^-2。

1.1.1 土壤样品采集

2017年9月下旬，在取样区内紫花苜蓿草地和玉米田各布设6个10 m×10 m的样方，按照“多点、等量、混合”的原则，每个样方内按“S”形选取10个采样点，用内径为5 cm的土钻于0~10、10~20 cm分层取样，四分法混匀，每层取1 kg左右的新鲜土样放入无菌自封袋内，共72份土壤样品，放入4 ℃冰盒带回。一部分新鲜土样用于土壤线虫的分离鉴定；另一部分土样于室内自然风干，研磨过筛后用于土壤理化因子测定。

1.1.2 测定方法

测定的土壤理化因子主要包括土壤有机碳、全氮、铵态氮、硝态氮、有效磷以及土壤含水量和pH。土壤有机碳测定用重铬酸钾-浓硫酸外加热氧化法；土壤全氮采用凯氏法蒸馏后用AA3-流动分析仪测定；铵态氮和硝态氮经0.01 mol·L^-1氯化钾溶液浸提后用AA3-流动分析仪测定；土壤有效磷采用碳酸氢钠-钼锑抗比色法；土壤含水量用烘干法；土壤pH采用玻璃电极法（pHS-3）按水土比2.5:1测定^[15]。

土壤线虫的测定：每份土壤样品取50 g新鲜土壤，利用改良的浅盘法^[16]于室内25 ℃下分离48 h。过筛后将土壤线虫冲洗于可立离心管中，静置2 h，弃掉上清液后离心管中剩余9 mL液体，加入约1 mL的固定液（9%福尔马林、1%甘油和2~3滴冰醋酸）保存，在显微镜下进行计数和到属水平的鉴定。土壤线虫数量折算成每百克干土中含有的线虫条数。鉴定采用形态学方法，参照文献[17]分类图。

根据土壤线虫不同类群的相对多度，划分不同类群的优势度，土壤线虫个体数占总捕获量10%以上为极优势属（+++++），占5%~10%为优势属（++++），占2%~5%为常见属（+++），占1%~2%为稀有属（++），占1%以下为极稀有属（+）^[17]。

土壤线虫多样性采用通用指数^[18]：香农-威纳指数（Shannon Wiener Index，H′）、丰富度指数（Margalef Index，SR）、优势度指数（Dominance，λ）来表示^[15]，H′用来表示物种多样性，多样性越高，所参与的食物网越稳定：

(1)

式中：p_i为第i个分类单元中个体所占的比例。

λ反映物种多度的分布状况：

(2)

SR反映群落物种丰富度，表示土壤线虫群落中种类的丰富程度:

(3)

式中：S为鉴定分类单元的数目；N为鉴定的线虫个体数目。

土壤线虫根据其取食习性和食道特征可分为食细菌线虫（Bacterivores，Ba）、食真菌线虫（Fungivores，Fu）、植物寄生线虫（Plant parasites，Pp）和捕/杂食线虫（Predators-omnivore，Op）。根据土壤线虫不同的生活史策略，分为由r-对策者向K-对策者过渡的5个c-p（Colonizer-persister）类群：c-p 1，世代时间短，繁殖速度快，典型的机会主义者，在食物富集的条件下能够快速增长，代谢快，耐环境压力；c-p 2，世代时间短，机会主义者，较耐环境压力；c-p 3，世代时间较长，对环境压力较为敏感；c-p 4，世代时间长，对环境压力敏感；c-p 5，世代时间很长，繁殖速度慢，对环境压力特别敏感^[19]。

土壤线虫群落功能结构通过总成熟度指数（∑MI）、自由生活线虫成熟度指数（MI）、植物寄生线虫成熟度指数（PPI）和通路指数（Nematode channel ratio，NCR）等来表征^[17]。

(4)

式中：ʋ（i）是在生态演替中属于K-选择和r-选择科属分别赋予的c-p值；f（i）是土壤线虫科/属在线虫种群中所占的比例。

NCR指数用于探测有机质的分解途径。土壤线虫群落的多个营养类群使它们有条件反映土壤食物网中的能流通道：当NCR=0时，为完全的真菌分解通道；NCR=1时，为完全的细菌分解途径；NCR=0.50可作为两种分解通路的临界值^[20]：

(5)

式中：B和F分别为食细菌线虫和食真菌线虫所占线虫总数的相对多度。

土壤线虫的结构指数（Structure index，SI）和富集指数（Enrichment index，EI）结合分析可以较好地指示干扰程度和食物网的变化以及对可利用资源的响应。SI和EI的值在0~100之间变化，可以50为临界点，将其组合形成一个象限图，划分为A、B、C、D四个象限：A象限（EI > 50，SI < 50）表示土壤受干扰程度较高；B象限（EI > 50，SI > 50）表示土壤受干扰程度较低，食物网稳定成熟；C象限（SI > 50，EI < 50）表示土壤未受干扰，食物网处于结构化的状态；D象限（SI < 50，EI < 50）表示土壤环境处于受胁迫状态，食物网退化^[17]。

(6)

(7)

式中：s代表Ba₃~Ba₅、Fu₃~Fu₅、Om₃~Om₅、Ca₂~Ca₅类群；e代表Ba₁和Fu₂类群；b代表Ba₂和Fu₂类群。

1.2 数据处理与分析

不同土层紫花苜蓿和玉米地土壤中的土壤理化性质（包括土壤含水量、pH、有机碳、全氮、铵态氮、硝态氮、有效磷）、土壤线虫数量和土壤线虫相对丰度以及土壤线虫多样性指数和生态指数均采用差异显著性比较t检验（Student-t test，P < 0.05）进行；土壤理化因子和土壤线虫相关性采用Pearson相关性分析。t检验和相关性分析运用IBM SPSS Statistics 21软件，作图运用Origin Pro 9.1软件。

2 结果与分析 2.1 退耕还草土壤理化因子变化

退耕种植紫花苜蓿草地与未退耕玉米田相比，0~10 cm土层含水量显著提高了15.86%，pH值显著降低了5.06%，有机碳、全氮、铵态氮和硝态氮含量增加但差异未达到显著水平；10~20 cm土层中，pH值显著降低4.57%，有效磷含量显著降低26.83%，土壤含水量、有机碳、全氮、铵态氮和硝态氮含量增加但差异未达到显著水平（表 2）。

2.2 退耕还草土壤线虫群落组成和营养类群变化

退耕种植紫花苜蓿草地共鉴定出土壤线虫18 307条，49个属，0~10 cm土层中线虫平均密度为488条·100 g^-1干土，真头叶属（Eucephalobus）、真滑刃属（Aphelenchus）和丝尾垫刃属（Fileuchus）是极优势属；10~20 cm土层线虫平均密度为507条·100 g^-1干土，真滑刃属和丝尾垫刃属是极优势属。未退耕玉米田共鉴定出土壤线虫10 706条，45个属，0~10 cm土层线虫平均密度为272条·100 g^-1干土，真头叶属、真滑刃属和丝尾垫刃属是极优势属；10~20 cm土层平均密度为319条·100 g^-1干土，真滑刃属和丝尾垫刃属是极优势属。短腔属（Brevibucca）、地单宫属（Geomonhystera）、无咽属（Alaimus）等仅在紫花苜蓿草地土壤中发现，而齿咽属（Odontopharynx）、单宫属（Monhystera）、类隐咽属（Paraphanolaimus）等仅在玉米田土壤中发现。土壤线虫丰度在退耕草地和未退耕农田之间存在显著差异（P < 0.05，图 1），退耕还草显著提高了土壤线虫的丰度。在退耕还草条件下，极优势属虽未发生改变，但伴生属已发生改变，土壤线虫群落组成发生改变（表 3）。

退耕种植紫花苜蓿草地与未退耕玉米田相比，土壤线虫各营养类群相对丰度差异不显著（图 2）。退耕种植紫花苜蓿草地土壤的通路指数分别为0.48（0~ 10 cm）和0.41（10~20 cm），未退耕玉米田土壤的通路指数分别为0.50（0~10 cm）和0.41（10~20 cm）（表 4），均不超过0.50，表明土壤中能流通道分解途径以真菌分解为主。

2.3 退耕还草对土壤线虫生态指数的影响

土壤线虫具有数量巨大、种群丰富等特点，因此常用生态指数表示其生态特征。在0~10 cm土层中，退耕种植紫花苜蓿草地土壤线虫的丰富度指数SR、香农-威纳指数H′显著高于未退耕玉米田，而优势度指数λ显著低于未退耕玉米田，退耕还草显著提高了0~10 cm土层中线虫群落的丰富度和多样性，显著降低了土壤线虫的优势度（P < 0.05）；10~20 cm土层中，退耕种植紫花苜蓿草地的优势度指数λ显著低于未退耕玉米田，而SR、H′指数无显著差异（表 4）。

在退耕种植紫花苜蓿草地和未退耕玉米田中，均表现为土壤线虫c-p 2类群占优势，占总数的59%~ 73%。与未退耕玉米田相比，退耕还草土壤线虫c-p 2类群占比有所降低，c-p 3~5类群占比则有所增加，且在10~20 cm土层中具有显著差异（图 3）。

退耕还草条件下，对土壤线虫的成熟度指数进行分析，0~10 cm土层中，自由生活线虫成熟度指数（MI）比未退耕玉米田降低，但不具有显著差异，植物寄生线虫成熟度指数（PPI）显著增加；10~20 cm土层中，MI值显著提高，PPI值降低，但不具有显著差异。从总成熟度指数（∑MI）来看，0~10 cm土层中，∑MI有所增加，但还未达到显著差异；在10~20 cm土层中，∑MI显著增加（表 4）。总体上，退耕还草改变了土壤线虫的成熟度指数。

由图 4可知，退耕种植紫花苜蓿草地0~10 cm土层的富集指数EI值为39.45~75.83，结构指数SI值为7.96~58.38，10~20 cm土层的EI值为50.38~79.78，SI值为39.94~74.06；未退耕玉米田0~10 cm土层EI值为5.60~95.20，SI值为4.80~64.00，10~20 cm土层EI值为51.75~81.90，SI值为15.04~71.03。0~10 cm土层中，退耕地更集中靠拢于A、B象限，未退耕农田分布于D象限的较多，说明退耕还草后土壤环境受到的干扰较低，食物网由退化向结构化状态发展；10~ 20 cm土层中，与退耕地的分布相比较，未退耕农田各样地更向B象限靠拢，表明退耕还草土壤受到的干扰程度降低，食物网趋向于成熟。

2.4 土壤线虫群落特征指数与土壤理化因子的关系

土壤线虫群落特征指数和土壤理化因子相关分析（表 5）表明，土壤含水量与土壤线虫N、Pp、H′、PPI、EI和SI呈极显著正相关（P < 0.01），与MI呈显著负相关（P < 0.05），与SR呈显著正相关（P < 0.05）；pH与土壤线虫N、H′、λ呈极显著相关（P < 0.01），与∑MI、SI呈显著负相关（P < 0.05）；有机碳与土壤线虫N、Pp、Op、MI、PPI呈极显著相关（P < 0.01），与SI呈显著相关（P < 0.05）；全氮与土壤线虫N和MI呈极显著正相关（P < 0.01），与PPI值呈极显著负相关（P < 0.01），与Pp和Op分别呈显著负相关和显著正相关（P < 0.05）；铵态氮与Pp、Op、MI和PPI呈极显著相关（P < 0.01），与∑MI呈显著正相关（P < 0.05）；硝态氮与土壤线虫N呈极显著正相关（P < 0.01），与SR呈显著负相关（P < 0.05）；有效磷与Ba、Fu和SR呈极显著相关（P < 0.01），与Pp呈显著负相关（P < 0.05）。

3 讨论

土地利用方式转变显著影响土壤团聚体和理化因子^[21-22]，极显著改变土壤生物学性质^[23]，导致土壤环境变化。退耕还草增加植被覆盖率，减少土壤侵蚀和水分流失，随退耕时间的推移，土壤碳汇效应逐渐显现^[24]，显著提高土壤有机碳和全氮的含量，有效改善土壤理化性质^[25-27]，提升土壤固碳及水源涵养能力^[28]，促进了土地的可持续性。本研究中退耕还草有效增加土壤有机碳和全氮含量，是因为紫花苜蓿为豆科植物，具有较强的固氮能力，且根系发达，根系分泌物及死亡对土壤有机质和全氮含量的积累有很大的贡献^[29]。段倩倩等^[30]研究发现豆科植物在固氮过程中能外排大量的H+，降低了pH值，这与本研究发现的退耕还草土壤pH显著降低的结果一致。在本研究中，退耕还草土壤速效磷含量显著降低，一方面可能是因为紫花苜蓿生长过程中需从土壤中吸收大量的磷元素^[31]，另一方面可能是因为紫花苜蓿的磷肥投入量比玉米田少了25%。综上所述，退耕还草有效提高了土壤含水量和土壤养分含量，为土壤线虫群落变化提供了条件。

研究发现退耕还草土壤线虫数量显著增加，群落结构发生改变，同时群落的稳定性显著提高。地上植物群落和土壤环境因子的改变都会影响土壤线虫群落组成^[32-33]，土壤线虫群落的变化与地上植物具有极强的相关性^[32]，植物通过地下根系生物量和分泌物改变土壤环境，作为初级消费者的植物寄生线虫和食微线虫数量发生相应改变，而捕/杂食线虫作为次级消费者也随之改变。土壤中各种营养成分的改变会对土壤食物网的复杂程度以及土壤线虫群落结构造成显著影响^{[18, 34]}，本研究发现土壤线虫数量与pH值呈极显著负相关关系，土壤pH值影响有机大分子物质的生物降解和矿化过程^[35]，且pH被认为是影响土壤微生物群落结构的重要因素^[36]，而土壤线虫与土壤微生物之间存在捕食关系^[37]，退耕还草通过改变土壤生境和地下微食物网结构影响土壤线虫群落和营养类群组成。本研究结果显示土壤线虫的食细菌类群和食真菌类群与土壤有效磷呈极显著相关关系，土壤中有效磷的降低影响土壤线虫的营养类群和成熟度指数，土壤有机碳与植物寄生线虫和捕/杂食线虫含量具有极显著相关性，土壤养分改变了土壤微食物网的结构与功能^[38]。

退耕还草不仅改变土壤线虫的群落组成，且影响土壤食物网的能量流动和土壤微食物网稳定性。Ingwersen等^[39]研究发现当土壤有机质丰富且分解较快时，土壤食物网能量流动更倾向于细菌分解通道；而土壤有机质缺乏且难分解时，土壤食物网能量流动更倾向于真菌分解通道。但是在本研究中退耕还草通路指数研究结果却显示土壤能流通道分解途径以真菌分解为主，退耕还草土壤中真菌类群占比最大，原因可能是退耕前长期的耕作导致土壤有机碳含量较低，在短时间内土壤仍然处于有机质缺乏的状态。成熟度指数在生态系统功能水平上可以更好地揭示土壤环境的健康状态^[19]。Urzelai等^[9]研究发现在陆地生态系统中草地土壤线虫的成熟度指数比长期耕作的农田系统高，本研究也发现退耕还草对土壤线虫群落的成熟度和稳定性有显著促进作用，且土壤线虫中r-对策者减少而K-对策者增加，世代交替变慢，土壤微食物网环境趋向于稳定，该结果与明凡渤等^[40]在农田中的研究结果一致。退耕还草减少了因耕作对土壤的扰动，土壤环境稳定性增加，促进土壤食物网向成熟方向发展。

4 结论

（1）丹江口水源涵养区坡耕地玉米田退耕还草种植紫花苜蓿3年，0~10 cm土层的含水量显著增加，土壤pH显著降低；在10~20 cm土层中，土壤pH和有效磷含量显著降低。

（2）退耕还草通过改变土壤pH、含水量、有机碳、全氮、铵态氮和有效磷含量促进了土壤线虫数量的显著增加，对土壤线虫营养类群产生了一定的影响，c-p类群的短世代型减少，长世代型增加，降低了世代交替和能量流动，群落多样性和稳定性增加，土壤线虫生态指数（成熟度指数、结构指数和富集指数）的变化揭示退耕种植紫花苜蓿土壤微食物网环境趋向于稳定，食物网趋向于成熟，地下生态系统更稳定。