化感作用是植物或微生物产生的代谢物对环境中其他植物或微生物有利或不利的作用^[1]，植物合成的化感物质主要通过植物体释放挥发、植物残体分解和根系分泌进入土壤。一些研究发现，松科、禾本科、豆科、玄参科等科属植物具有化感作用，并鉴定出了皂苷类、酚酸类、有机酸、芳香族化合物等多种化感物质^[2-7]。这些化感物质有些可以抑制其他植物的生长，表现出种间抑制性，有些则抑制了自身种子萌发、幼苗，表现出自毒作用，因此，研究化感作用对于深入了解植物种间、种内个体之间的相互作用具有重要的科学意义^[8]。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是豆科苜蓿属多年生草本植物，具有耐盐性强、抗逆性强、分布广等特点^[9]。紫花苜蓿在农业上是优良牧草，在园林上因其具有较高观赏性常用于规模化种植^[10]。紫花苜蓿株高40~50 cm，枝叶翠绿，紫色总状或头状花序聚生枝端非常艳丽，因此工程上常用来单独成片种植或者同蜀葵相间种植或混合种植，以期获得立体、丰富多彩的景观效果。蜀葵（Althaea rosea Cavan）是锦葵科蜀葵属多年生草本植物^[9]，株高一般为80~150 cm，具有生物量大、耐受性强等特点，适合广泛栽培。蜀葵花色艳丽多样，花瓣中的紫色素易溶于酒精及热水，可用作食品着色剂。蜀葵茎皮纤维可替代麻用，全草可入药，具有清热凉血的功效^[11-12]。园林工程实践中多注重服务半径和园林设计，而常忽略植物间相互作用的问题，使植物配置缺乏科学性。化感作用存在一定的作用范围，在进行景观设计时应该避免在小范围内种植相互抑制的植物，这样既可防止植物群落的单一化，提升景观设计效果，又可以减弱植物间的相互干扰。因此研究植物的化感作用对于明确植物种间关系和保持园林人工生态系统的稳定性均具有重要意义^[13-14]。

早期的研究表明，紫花苜蓿的化感作用较强，表现一定的自毒效应^[15-18]。目前，对于紫花苜蓿化感作用的研究大多涉及化感现象的观察、化感物质的分离提取和鉴定等方面，对于其化感作用受体的研究只局限在蔬菜、牧草、杂草等^[19-23]，而对园林植物影响研究较少。为研究紫花苜蓿对蜀葵的化感作用，本研究通过研究紫花苜蓿根际及距紫花苜蓿根际不同距离处的表层土壤中化感物质含量，探讨紫花苜蓿的化感作用空间范围；通过培养皿滤纸培养法和盆栽间作试验研究紫花苜蓿对蜀葵的化感作用，为紫花苜蓿草地的更新、紫花苜蓿与其他园林植物的混种等园林绿化工程的管理和实践提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

供试紫花苜蓿种子购自北京芳萱苑种子有限公司，蜀葵种子采自天津市蜀葵适生区。土样采自紫花苜蓿种植地。自紫花苜蓿草丛边缘开始，去除表层枯枝落叶，采集根际及距离根际半径为20、40、60 cm的5~10 cm表层土，土样装塑封袋中置于4 ℃冰盒带回实验室。挑去植物细根后，称取土样各10 g，分别置于锥形瓶中，每瓶中加入100 mL蒸馏水，封口，摇床150 r·min^-1振荡12 h，取下后静置12 h，再经3500 r·min^-1离心10 min后取上清，得到土壤浸提液。

1.2 土壤有机酸含量测定

紫花苜蓿根际及距根际不同距离的土壤有机酸类化感物质采用高效液相色谱法（HPLC）进行测定^[24]。采用C18反相柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱温25 ℃，进样量20 μL，流速1 mL·min^-1，流动相为乙腈-0.1%磷酸（2:98，V/V）水溶液，检测波长为210 nm。

1.3 化感作用的生物检测

采用培养皿滤纸发芽法进行紫花苜蓿土壤化感效应的生物检测^[25]。实验设置土壤浸提液R（紫花苜蓿根际土壤浸提液）、D20、D40、D60（距紫花苜蓿根际半径分别为20、40、60 cm处土壤浸提液）4个处理，3次重复。培养皿中铺两层滤纸，分别加入土壤浸提液并使滤纸保持湿润。蜀葵种子经3% H₂O₂溶液消毒10 min，蒸馏水冲洗3次，转入各培养皿中，每皿20粒，将培养皿放置在（25±1）℃人工气候箱中培养。每日补充等量适量的土壤浸提液，以蒸馏水为对照（CK），每隔24 h记录各处理及对照发芽数。培养7 d后从各皿中随机选取10株幼苗，测定根长、苗长，计算发芽率（Germination percentage，GP）、发芽指数（Germination index，GI）、化感指数（Response index，RI）、化感综合效应指数（Mean of RI，M）等指标^[26-27]，各指标采用如下公式计算：

发芽率GP=总发芽数/供试种子数×100%

发芽指数GI=∑（G_t/D_t）

式中：G_t为t日的发芽数；D_t为相应的发芽日数。

化感指数RI=T/C-1（T < C）；RI=1-C/T（T≥C）

式中：C为对照值；T为处理值。

化感综合效应指数M=（∑a）/n

式中：a代表同一处理下的各指标的RI；n为测定指标的总个数。

1.4 盆栽试验

采用盆栽法进行间作实验。紫花苜蓿和蜀葵种子经3% H₂O₂溶液消毒10 min、蒸馏水冲洗3次后转入育苗盘中，种子萌发后待蜀葵幼苗长出3片叶时，将两种植物幼苗移入花盆中。间作处理每个花盆保留蜀葵1株、苜蓿5株，在室外遮雨网室中培养，期间定时定量浇水，保持水分为田间持水量的60%左右。培养60 d后取样进行生理实验，70 d培养结束后将蜀葵连根取出，用蒸馏水和去离子水清洗，晾干后用剪刀将根部与地上部分开，置于烘箱中105 ℃杀青30 min后80 ℃烘干至恒质量，称量根部与地上部生物量。叶绿素含量采用紫外分光光度法测定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定^[28]。

1.5 数据分析

利用Microsoft Excel 2013和SPSS 20.0软件进行数据处理和统计分析，采用单因素方差分析和最小显著差异法检验种子萌发指标的差异显著性，对间作处理下生理生态指标进行t-检验。

2 结果与分析 2.1 不同距离处土壤中有机酸类化感物质的含量

HPLC法定量检测紫花苜蓿根际及距根际不同距离处的土壤中5种有机酸类化感物质含量，以有机酸溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标制作标准曲线，5种有机酸（水杨酸、苹果酸、草酸、柠檬酸、富马酸）在1~100 μg·mL^-1浓度范围内均呈现良好线性关系，得到线性回归方程分别为y=10 109x+28 094（R²=0.999 3）、y=802.84x+41 254（R²=0.998 6）、y=8 721.5x+37 942（R²=0.996 4）、y=697.68x+6 566.4（R²=0.984 5）、y=106 252x-39 344（R²=0.999 4）。

根据回归方程分别计算各处理土壤中5种有机酸含量，结果（表 1）显示，根际土壤浸提液的有机酸含量较高，随着距离的增加，根区土壤中有机酸含量降低，表明有机酸类化感物质的含量及分布与距紫花苜蓿植株的距离有关，呈现明显的空间分布特征。

2.2 紫花苜蓿不同土壤浸提液对蜀葵种子萌发的影响

各土壤浸提液处理对蜀葵种子发芽均产生影响。由图 1可知，蜀葵各处理的发芽率均低于对照，R处理对种子萌发抑制作用最大，与对照相比发芽率显著降低了6.23%，各土壤浸提液处理间发芽率差异不显著。由表 2可知，各处理蜀葵发芽指数均低于对照，其中R处理下发芽指数与对照相比显著降低了31.32%（P < 0.05）。各处理蜀葵根长和苗长随距离的增加总体呈现增加的趋势，R处理的蜀葵根长和苗长均最小，与对照相比分别显著减少了56.11%和48.94%（P < 0.05）。

2.3 紫花苜蓿不同土壤浸提液对蜀葵种子萌发的化感效应

化感综合效应指数是衡量各萌发指标化感指数的综合效应，其绝对值的大小反映了化感效应的强弱。比较化感综合效应指数（表 3）可以看出，距紫花苜蓿根际越近的土壤浸提液对蜀葵生长产生的抑制作用越强，根际土壤浸提液的抑制作用最强，当距离继续增加时，土壤浸提液对蜀葵抑制作用逐渐减弱。说明紫花苜蓿生长过程中产生的化感物质对周围植株有一定的影响，影响的大小与距紫花苜蓿植株的距离有关，距紫花苜蓿植株越近，受其化感作用的影响越严重。

2.4 紫花苜蓿与蜀葵间作的化感效应

与单种相比，紫花苜蓿与蜀葵间作时蜀葵植株较弱小，地上部生物量显著减少了8.01%（P < 0.05），由于与紫花苜蓿根系直接接触而受到其释放的化感物质的影响，蜀葵根部生物量相比于单种时显著减少了23.99%（P < 0.01）。间作时蜀葵的叶绿素合成受到抑制，叶绿素含量与单种时相比极显著降低，同时MDA含量与单种相比显著升高了15.72%（P < 0.05），可溶性蛋白含量与单种相比无显著差异（表 4）。

3 讨论 3.1 紫花苜蓿根区土壤中化感物质的空间效应

化感物质是植物生命活动中产生的次生代谢物质，大多数为小分子的酚、酸，它们影响植物的生长调节、光合作用、呼吸代谢、营养吸收、蛋白质和核酸代谢等生命活动^[2]。植物根系能够分泌多种具有生物活性的化感物质，这是化感物质进入环境的重要通道^[29-30]。植物根系分泌的酚类化合物是抑制植物生长的重要物质^[31]，Pérez等^[32]研究发现野燕麦根系分泌的对羟基苯甲酸、香草酸等化感物质对春小麦胚根和胚芽生长有显著抑制作用。紫花苜蓿根区土壤中含有多种化感物质，赵瑞林等^[33]采用GC-MS检测鉴定出，紫花苜蓿根际土壤中化感物质包括各种直链烷烃、环烷烃、烯烃、醇类、酚酸和芳香族化合物等多种物质，且根际土的邻苯二甲酸二丁酯等化感物质含量均高于非根际土。本研究中，紫花苜蓿土壤中的化感物质含量随着距根系距离的增加而减少，反映了化感物质的空间效应和浓度效应。

紫花苜蓿具有一定的自毒效应，种植多年后会越来越稀疏，并且与其伴生的植物也会减少^{[16, 25, 34]}。通过研究比较紫花苜蓿、黄花草木樨等几种豆科牧草地上部水浸提液的化感效应发现，黄花草木樨对稗草种子发芽率有显著抑制作用，而紫花苜蓿对稗草幼苗生长表现出了明显的抑制作用，但随着水浸提液浓度升高抑制效应的增强不再显著^[27]。本研究表明，紫花苜蓿根系不同距离的土壤浸提液对蜀葵种子萌发产生抑制作用，在幼苗发育过程中则呈现出“近抑远不抑”的趋势，距离紫花苜蓿植株较近处的土壤浸提液显著抑制蜀葵根和苗的生长，较远处的土壤浸提液则对蜀葵的生长无显著抑制作用，这可能是化感物质空间分布的结果，即距离较远处化感物质含量低，从而未表现出抑制效果，这与已有研究^{[17, 35-36]}结果相似。

3.2 间作处理对蜀葵生长的影响

化感作用受到化感物质来源、浸提液浓度、受体植物种类和不同生命时期的敏感程度等因素的影响^{[18, 37-38]}。紫花苜蓿根际土壤浸提液对蜀葵种子发芽指数的抑制作用强于发芽率，这表明土壤中化感物质使种子在萌发前发生劣变，从而延缓种子发芽时间。在蜀葵生长期，间作会使植株总生物量降低，其中根部生物量的减少更明显，可能是由于根直接接触化感物质，而地上部受到的影响有一定滞后性^[23]。研究表明，化感胁迫往往伴随氧化胁迫的发生^[39]，在间作处理中蜀葵经化感物质胁迫而产生活性氧（ROS），活性氧自由基将叶绿素等作为靶标，破坏其合成，使叶绿素含量减少。MDA含量是反映脂质过氧化作用强弱的重要指标，间作处理下的MDA含量升高，说明化感物质在一定程度上破坏了细胞膜系统，渗透调节物质可溶性蛋白对化感胁迫反应不敏感，但仍在细胞中进行积累以降低化感作用对自身的危害。

4 结论

（1）HPLC检测结果表明根际土壤化感物质含量高于非根际土壤，证明根际土壤化感效应强于非根际土壤。

（2）紫花苜蓿土壤浸提液对蜀葵种子萌发有抑制作用，随着与根际距离的增加，紫花苜蓿土壤浸提液对蜀葵根和苗生长的抑制作用减弱。

（3）间作处理下蜀葵生物量和叶绿素含量降低，紫花苜蓿产生的化感作用刺激蜀葵产生应激反应，丙二醛和可溶性蛋白含量升高。因此，在实践中应避免两种植物种植过密，至少保持种植间距不小于60 cm。