我国秸秆资源丰富，据估计我国每年产生3.27亿t玉米秸秆^[1-2]。大部分玉米秸秆最后都自然腐解或直接焚烧，不但会破坏土壤表层有机质，还会引起空气污染，对人类健康造成危害^[3]。玉米秸秆富含有机质，蛋白质与脂肪也占有一定比例，基本组织构成以纤维素、半纤维素及木质素为主^[4]，在饲料、肥料、燃料、食用菌原料、加工原料等方面具有很高的开发利用价值^[5]。

秸秆饲料化是解决目前畜禽养殖业饲料原料短缺的有效途径，生物处理具有能耗低、污染小、易于操作等优点，可依靠微生物和酶制剂进行生物降解及生物转化^[6]，如利用乳酸菌发酵，其发酵液可以改善秸秆饲料风味和营养价值^[7]。秸秆发酵时接种乳酸菌可以迅速增加农作物表面的乳酸菌数目，使乳酸发酵占主导地位，从而降低pH值，抑制有害微生物的活动，保存和提高饲料营养价值^[8]。然而由于玉米秸秆的细胞壁成分含量较高，营养价值不能显著提高，限制了乳酸菌的饲用范围。

纤维素酶作为水解纤维素的“工具”，用途广泛，主要应用于制备生物能源，汤斌等^[9]、李旭东等^[10]研究纤维素酶在稀酸作用下对秸秆产燃料乙醇的预处理效果，分别发现以质量分数0.8%或4%的稀硫酸处理可获得最佳效果。除了制备生物能源之外，纤维素酶还可以制备成饲料添加剂、织物洗涤剂、造纸工业等有关的酶制剂等投入工业生产^[11]。纤维素酶在饲料添加剂方面的研究主要是通过向秸秆中添加具有分解纤维素能力的酶制剂，在密封发酵的过程中，使秸秆中的部分纤维素降解为可溶性糖。万里强等^[12]研究表明，青贮苜蓿中加入纤维素酶能发酵纤维素分解产生戊糖、乳酸和少量乙酸，而无二氧化碳生成，有利于抑制腐败菌生长，提高饲料的贮藏期。尽管在青贮饲料中添加纤维素酶有很多优点，但目前该研究领域仍有许多问题制约其发展：如生产成本较高，青贮饲料中添加纤维素酶稳定性不高等^[13]。

酿酒酵母广泛应用于食品、酿造及生物能源生产等领域，良好的细胞活性有利于增加生物量的积累，促进细胞循环使用，提高发酵效率^[14]。目前，酿酒酵母用于发酵研究多集中在产乙醇领域，将酿酒酵母用于玉米秸秆青贮发酵的研究较为少见。玉米秸秆中接种酿酒酵母可以缓解或解除游离SO对菌群的抑制作用，使乳酸菌在青贮过程中迅速增殖形成优势菌群，促进乳酸的形成和积累，使原料的pH值迅速降低^[15]。

确保青贮成功的关键因素是保持乳酸菌持续累积乳酸并维持较低pH值^[16]，而秸秆中可溶性碳水化合物较少，直接青贮较难^[17]。需要使用能够分解纤维素的酶制剂提供可溶性碳水化合物，才能维持乳酸菌发酵^[18]，但纤维素酶会因酶解产物产生反馈抑制作用，酶解效率不高^[19]。本研究以构建表达纤维素酶的酿酒酵母为基础，希望通过乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂间协同发酵，降解部分纤维素为乳酸菌提供发酵底物，加速乳酸菌发酵进程，提高玉米秸秆发酵效果^[20]，并同时解除纤维素酶的反馈抑制作用^[21]。使用全细胞酿酒酵母纤维素酶在发酵的玉米秸秆中自行繁殖，既可促进乳酸菌发酵，又可不受添加量较小的限制，降低纤维素酶成本。且酿酒酵母能提供大量丰富单细胞蛋白，可提高玉米秸秆饲用品质。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 原料

回收的玉米秸秆剪短至2~4 cm，在55 ℃烘箱中烘至恒重，于干燥阴凉处保存备用。玉米秸秆原料成分如表 1所示。

1.1.2 菌株和质粒

大肠杆菌Escherichia coli DH5α-Gold用于质粒构建，菌种实验所用单一菌种为木聚糖酶与纤维素酶共生型酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）pHBM368- PGK-CBH，由湖北大学工业生物技术湖北省重点实验室保藏的原始载体pHBM368-PGK经重组构建而成。实验所用复合乳酸菌发酵剂（购自北京川秀科技有限公司），商用青贮菌剂、秸秆发酵剂购自农富康生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

筛选重组菌培养基为LA固体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1%氯化钠，1.5%琼脂粉，37 ℃用于重组菌培养。添加100 μg·mL^-1的氨苄青霉素。

活化酿酒酵母培养基为液体YPD培养基：蛋白胨2 g，酵母抽提物1 g，葡萄糖2 g，蒸馏水100 mL。

活化乳酸菌制剂培养基为液体LB培养基：蛋白胨1 g，酵母抽提物0.5 g，氯化钠1 g，蒸馏水100 mL。

活化商用青贮菌剂培养基为蔗糖培养基：蔗糖10 g，蒸馏水150 mL。

LB培养基及蔗糖培养基用高压灭菌锅在121 ℃灭菌30 min，YPD培养基用高压灭菌锅108 ℃灭菌20 min，接种前均置于无菌操作台紫外灭菌30 min。

1.2 试验方案 1.2.1 纤维素酶表达载体pHBM-368-PGK-CBH构建

根据CBH2基因序列设计一对引物Cbh2f（5 ′ AATTACGTATTTGCTTTGATTGTTTTTGC3 ′，下划线为SnaB Ⅰ酶切位点）和Cbh2r（5′ TAACCTGAGGCTAATAAGTGCTATCAATCG 3′，下划线为Eco81 Ⅰ酶切位点），以pPIC9K-CBH2为模板，PCR扩增得到目的基因CBH2（表 2）。将原始质粒368-PGK用SnaB Ⅰ和Eco81 Ⅰ两个限制性内切酶进行酶切，暴露出载体上两端黏性末端。将PCR扩增得到的CBH2同样用SnaB Ⅰ和Eco81 Ⅰ酶切后回收。

将酶切处理回收后的CBH2和载体pHBM368- PGK片段混合，通过T4 DNA连接酶在16 ℃反应过夜。连接产物以E.coli DH5α-Gold感受态为宿主进行常规转化，涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基中，37 ℃过夜培养，挑取重组子单菌落（图 1）。

1.2.2 秸秆饲料化应用效果评价

为研究乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合使用是否与其单独使用发酵效果有所差异，应用效果实验设置为5个发酵组合，分别是：A组（乳酸菌制剂发酵）、B组（全细胞酿酒酵母纤维素酶发酵）、C组（乳酸菌制剂与全细胞酿酒酵母纤维素酶混合发酵）、D组（商用青贮剂发酵）、E组（自然发酵），另用相同来源而未发酵的秸秆设置为F组（对照），每个组各设置3个平行样品，实验组添加玉米秸秆原料均为50 g，添加发酵添加剂液体均为100 mL（生物量通过OD₆₀₀标定）。但乳酸菌制剂活化使用的LB培养基相关培养原料（主要成分为1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物和1%葡萄糖）中氮源含量只有全细胞纤维素酶制剂活化使用的YPD培养基（主要成分为2%蛋白胨、1%酵母抽提物和2%葡萄糖）的一半，为确保各实验组额外氮源添加量的一致，使用LB培养基活化的乳酸菌制剂取100 mL，而使用YPD培养基的全细胞纤维素酶制剂取50 mL，以此推算混合发酵组取25 mL全细胞纤维素酶制剂与50 mL乳酸菌制剂混合，商用青贮剂按使用方法需50 mL，各实验组都稀释至100 mL使用。处理体系见表 3。将烘干后的玉米秸秆倒入1000 mL容量烧杯中，将菌液与水按表 1中的量混合后倒入喷壶中，均匀喷洒在秸秆上，并不断搅拌，直至喷洒完毕后静置15 min使秸秆充分吸收菌液，将处理好的样品倒入真空包装袋中，使用真空封口机封口后于28 ℃恒温培养箱中恒温发酵14 d。

1.3 测定项目及方法

感官评价：分别从气味、色泽、质地、形态四个指标以效果最差为1分、效果最好为5分，分四个维度进行综合评价，发酵玉米感官评价标准见表 4。

总氮（TN）含量：经硫酸消化法得到液体成分，采用碱性过硫酸钾氧化紫外分光光度法测定^[22]。

铵态氮（NH₄⁺-N）含量：经硫酸消化法得到液体成分，采用苯酚-次氯酸钠比色法测定^[23]。

纤维素含量：通过美国国家可再生能源实验室（NREL）方法^[24]水解得到液体成分，采用蒽酮硫酸比色法测定^[25]。

半纤维素含量：经硝酸钙预处理后，采用2 mol· L^-1盐酸水解法得到液体成分，调节pH值后采用DNS法测定^[26]。

采用SAS软件对数据进行差异性分析（LSD法，α=0.05）

2 结果与讨论 2.1 全细胞酿酒酵母纤维素酶构建及功能分析

挑取重组子单菌落，酶切鉴定后测序验证。将测序正确的pHBM368-PGK-CBH2质粒经HpaⅠ酶切线性化，用电转化法将线性DNA转化到酿酒酵母中，涂布于营养缺陷型SC平板上，从营养缺陷型的SC平板上挑取单菌落至YPD平板，28 ℃培养促使其生长。挑取重组酵母的单菌落，转接至含有1%羧甲基纤维素（CMC）的YPD平板，加入刚果红染色液，观察菌落周围出现水解圈，见图 2，表明纤维素酶成功在营养缺陷型酿酒酵母中分泌表达，对照菌株则没有水解圈。

筛选出的菌落经过扩大培养后即为全细胞酿酒酵母纤维素酶，扩大培养后用于后续的玉米秸秆发酵。

2.2 发酵感官评价

发酵玉米秸秆的感官评价是进行饲料化应用中的基础评价指标，通过评价发现，乳酸菌发酵与全细胞纤维素酶混合发酵的玉米秸秆在气味和形态上均有较大改善，相比而言酸香味适中且有淡淡酒香，形态上糜烂程度减轻，结块现象减少，综合评价结果见表 5，混合发酵的玉米秸秆总体上优于其他处理组合。

2.3 不同发酵添加剂对粗蛋白含量的影响

粗蛋白含量是评价饲料营养价值的重要指标，结果见图 3，各发酵处理对玉米秸秆粗蛋白含量无显著影响（P>0.05），乳酸菌发酵、全细胞纤维素酶发酵及混合发酵样品中粗蛋白含量分别达到115.01、117.06 mg·g^-1和109.53 mg·g^-1。商用青贮剂发酵粗蛋白含量为99.26 mg·g^-1，明显低于全细胞纤维素酶发酵组，可能是由于商用青贮剂中含有导致氮源损失的微生物类群。

2.4 不同发酵添加剂对NH₄⁺-N含量的影响

NH₄⁺-N含量是衡量秸秆发酵效果的重要指标，是由腐败菌分解饲料中的蛋白生成，NH₄⁺-N含量越高，发酵饲料的营养价值和品质就越低，因此NH₄⁺-N含量可以反映不同发酵添加剂对玉米秸秆饲料化处理的效果。乳酸菌发酵、全细胞纤维素酶发酵、混合发酵、商用青贮剂发酵均对玉米秸秆NH₄⁺-N含量有显著影响，见图 4，乳酸菌发酵、全细胞纤维素酶发酵、混合发酵引起NH₄⁺-N含量显著上升（P＜0.01），商用青贮剂发酵引起NH₄⁺-N含量显著下降（P＜0.01）。采用乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵的玉米秸秆NH₄⁺-N含量为3.651 mg·g^-1，且其铵态氮与总氮比例（NH₄⁺-N/TN）值为0.21，与乳酸菌单独发酵、全细胞纤维素酶单独发酵NH₄⁺-N/TN值相差不大，说明乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵不会引起NH₄⁺-N/TN值的大幅上升，即二者用于混合发酵时不会造成饲料中的蛋白过量分解。但与商用青贮剂相比，其NH₄⁺-N/ TN值仍属较高范畴，在后续研究中应关注如何降低发酵过程中蛋白质的损失。

2.5 不同发酵添加剂对纤维素比例的影响

非瘤胃动物无法直接消化利用纤维素，纤维素是玉米秸秆用作饲料时的一个重要评价指标。由图 5可知，乳酸菌单独发酵和全细胞纤维素酶单独发酵均对纤维素比例有影响（P＜0.05），混合发酵和商用青贮剂发酵引起纤维素比例显著下降（P＜0.01）。对比A、B、C三组样品的纤维素比例，乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵的玉米秸秆纤维素比例最低，为28.41%，相比未发酵玉米秸秆降低15.03个百分点，与商业青贮剂发酵效果相当，其纤维素含量比全细胞纤维素酶制剂单独发酵和乳酸菌单独发酵明显降低（P＜0.05）。由于在酶解过程中，产生的纤维二糖和葡萄糖对整个反应具有抑制作用，使得纤维素酶酶解效率不高，当酶解产生的纤维二糖和葡萄糖被乳酸菌、酵母菌利用时，可以解除纤维二糖及葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用，因此混合发酵情况下可提高纤维素酶的酶解效果。

2.6 不同发酵添加剂对半纤维素比例的影响

半纤维素与纤维素合称膳食纤维，且在膳食纤维中占50%以上，饲料中充足的膳食纤维可以提供饱腹感，但其消化率低，不能被非瘤胃动物充分消化吸收。由图 6可知，乳酸菌单独、全细胞纤维素酶单独发酵、自然发酵对玉米秸秆半纤维素比例无显著影响（P>0.05）。比较A、B、C组可发现：乳酸菌发酵玉米秸秆和全细胞纤维素酶制剂发酵的玉米秸秆半纤维素含量与空白样品无显著差异，说明乳酸菌用于秸秆发酵时不能很好地降解半纤维素，乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵的玉米秸秆半纤维素比例最低，为19.50%，相比未发酵玉米秸秆下降2.70个百分点，说明乳酸菌与全细胞纤维素酶制剂混合发酵可以提高发酵玉米秸秆的半纤维素降解效果。

3 结论

（1）乳酸菌剂和全细胞酿酒酵母纤维素酶混合处理秸秆可有效提高秸秆饲料中纤维素、半纤维素降解效率，提高秸秆饲料利用效率。

（2）乳酸菌剂和全细胞酿酒酵母纤维素酶混合处理秸秆可有效提高秸秆饲料中单细胞蛋白含量，提升秸秆饲料品质。

（3）全细胞酿酒酵母纤维素酶在秸秆饲料青贮中具有很好的应用前景。