2019, Vol. 36
2. 苏州建邦环境修复有限责任公司, 江苏 苏州 215000
2. Suzhou Built State Environmental Restoration Co., Ltd., Suzhou 215000, China
雌激素是一种内分泌系统产生的女性荷尔蒙，它与人类的生殖、骨骼以及大脑的发育密切相关[1]。但排入环境中的雌激素能够通过模拟、干扰或对抗机体内生激素原有的正常合成和释放，从而破坏自身内分泌系统的平衡和正常调节作用。环境中的雌激素包括天然雌激素和人工合成雌激素[2]。雌二醇（E2）、雌三醇（E3）等天然雌激素可通过动物自身分泌产生，炔雌醇（EE2）、双酚A（BPA）等人工合成雌激素均通过化学合成产生[3-4]。畜禽粪便被认为是环境中雌激素的主要来源，畜禽粪便及其周围土壤、污水中已检测出天然雌激素和人工合成雌激素[4-5]。现行的畜禽粪便处理方式主要为短期内简单堆置之后施用到农田[6-7]。然而研究表明，雌激素在自然环境中降解效率非常低，畜禽粪便中雌激素的残存效应风险很大[8-10]。如何去除畜禽粪便中雌激素已成为当前该领域研究的一个重点。
堆肥法是目前处理有机固体废弃物的有效方法，已广泛应用于营养物、兽药和抗生素降解的研究[11-15]。目前，有关堆肥过程畜禽粪便中雌激素降解研究主要集中于天然雌激素[16-18]。王代懿等[16]采用微型试管堆肥法模拟牛粪中雌激素降解，发现堆肥过程中天然雌激含量大幅降低，其中17β-雌二醇（17β-E2）去除率达100%。郑溪[17]以牛粪和稻草为原料进行堆肥时发现17β-E2、E3能够快速降解。而对堆肥过程中人工合成雌激EE2、BPA降解鲜有报道[19-20]。但在实际畜禽粪便中常同时检出两类雌激素，开展畜禽粪便中天然雌激素和人工雌激素研究，对评估雌激素污染程度和迁移转化具有重要意义。
本文采集了南京附近养殖场的鸡粪、猪粪、牛粪，对其天然雌激素E3、17β-E2和人工合成雌激素EE2、BPA含量进行了测定。采用鸡粪、猪粪、牛粪为堆肥原料，着重研究了堆肥效果及四种雌激素降解特征，并以牛粪堆肥为代表分析了不同翻堆频率对堆肥过程中雌激素降解的影响，以阐释畜禽粪便激素污染特征和堆肥降解特征，为雌激素风险防控提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 标准品及堆肥原料雌三醇（E3，98%）、17β-雌二醇（17β-E2，98%）、双酚A（BPA，99%）标准品均购自上海晶纯试剂有限公司，炔雌醇（EE2，99%）标准品购自美国Sigma公司。四种雌激素理化性质见表 1。甲醇（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯）和乙腈（色谱纯）购自南京化学试剂股份有限公司。
堆肥原料是新鲜的鸡粪、猪粪、牛粪，采自南京三个养殖场。在每个养殖场的不同位置采集3份当日排泄的新鲜粪便样品并混合，用黑色塑料袋进行密封，运回实验室。大部分粪便样品用于堆肥，少量样品进行冷冻干燥处理。冻干后的粪便样品用研钵研磨，过20目筛后避光、冷冻保存待用。选用南京市某大学校园树叶作为堆肥原料的调理剂。烘干法测定粪便和树叶含水量，采用《有机肥料》（NY 525—2012）对粪便、树叶样品中有机质、氮、磷和钾等的测定方法进行检测。堆肥原料理化性质见表 2。
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表 2 堆肥原料理化性质 Table 2 Physical and chemical properties of the composting raw materials |
树叶取回后采用粉碎机打碎至2~5 mm，分别与鸡粪、猪粪、牛粪充分混合，控制堆体的初始碳氮比为30:1左右。加水，使堆体的水分含量保持在60%左右。建成1 m×1 m×1.2 m的堆体，表面覆盖塑料膜，防止水分过量蒸发。通过人工翻堆自然通风供给氧气。鸡粪、猪粪、牛粪堆肥翻堆频率为每日翻堆两次，牛粪堆肥还设置了不翻堆、两日一翻堆两组处理实验。在每日10：00、14：00、20：00，将温度计插入距堆体顶端70 cm中心处测定温度，取其平均值为当日堆体温度。堆肥的第1、2、4、8、16、32 d，采集并检测各堆肥处理样品中四种雌激素残留率，每种处理均设置3次重复。
1.3 雌激素检测方法本实验采用超声提取（UE）-固相萃取净化（SPE）-高效液相色谱（HPLC/FLD）法[23]检测畜禽粪便中雌激素含量。称取冷冻干燥并经研钵研磨后过20目筛的（1.00±0.01）g粪便样品于30 mL的玻璃离心管中，然后加入1.00 mL的雌激素（空白组加入等量的甲醇）混合标准溶液（1 mg·L-1），混合均匀后放置12 h，再加入20 mL提取剂（乙酸乙酯），涡旋30 s后超声提取30 min，并以4500 r·min-1离心30 min，上清液转入另一离心管，重复提取1次，合并2次提取液，以4500 r·min-1离心20 min，取上清液在40 ℃的恒温水浴下氮气缓慢吹干，用甲醇溶解、超纯水稀释至50 mL容量瓶中待用。每次试验分别做三个平行。
自制C18固相萃取柱（200 mg/6 mL），用5.00 mL甲醇和5.00 mL超纯水活化，然后将提取后的样品溶液控制流速3~5 mL·min-1过固相萃取柱，用5.00 mL超纯水淋洗柱体并继续抽吸3.0 min，淋洗后的萃取柱用15.00 mL体积比为1:1的甲醇和乙酸乙酯混合液洗脱，洗脱液收集至小试管中。将小试管置于40 ℃的恒温水浴下氮气缓慢吹干，然后加入甲醇溶液涡旋混合将附着物重新溶解至2.00 mL，过0.22 μm孔径滤膜后，HPLC/FLD分析。色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS-SP-C18（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇/乙腈/水（体积比为20:30:50）；流速0.80 mL·min-1；柱温40 ℃；进样量20 μL；荧光检测器波长采用波长切换，切换方式如下，0~5.0 min激发/发射波长为300/450 nm，5.0~6.1 min激发/发射波长为280/ 310 nm，6.1~10.0 min激发/发射波长为300/450 nm，10.0 min之后激发/发射波长为280/310 nm。
所建立分析方法的线性范围为1.00~1 000.00 μg·L-1，且相关性良好（r>0.999 5）。E3、17β-E2、BPA和EE2的加标回收率为75.1%~104.6%（RSD=1.5%~ 5.3%）、81.0%~117.0%（RSD=1.7%~5.7%）、78.6%~ 100.8%（RSD=0.6%~2.1%）和79.3%~88.4%（RSD= 1.4%~5.0%），检出限分别为3.35、2.13、5.01、1.12 μg· kg-1。
1.4 统计与分析数据经Excel 2013预处理后用SPSS 20.0单因素方差分析（One-way ANOVA）中的最小显著性差异法（LSD）进行不同处理间各项指标的显著性差异检验，P＜0.05视为统计学上具有显著性差异。
2 结果与分析 2.1 畜禽粪便中雌激素种类和含量特征新鲜鸡粪、猪粪、牛粪样品中雌激素E3、17β-E2、EE2和BPA含量结果如表 3所示。三种粪便中均检测出高含量的天然雌激素17β-E2，鸡粪和猪粪中还检测出天然雌激素E3。但牛粪中未检测出天然雌激素E3，因E3主要残留在牛的尿液中。此外，鸡粪中检测出人工合成雌激素EE2，而牛粪中不仅检测出EE2还有人工合成雌激素BPA。由于不同雌激素活性不同，研究中常用17β-E2活性当量（EEQ）表征样品中总雌激素当量浓度[24]，见式（1）：
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表 3 堆肥前后3种畜禽粪便样品中雌激素含量 Table 3 The estrogen concentration in three livestock manures before and after composting |
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(1) |
式中：EEQ为畜禽粪便中17β-E2活性当量浓度，μg· kg-1；Ci为各雌激素浓度，μg·kg-1；EEFi为不同雌激素的17β-E2活性当量系数（表 1）。三种新鲜畜禽粪便中雌激素EEQ大小顺序为鸡粪（3 595.86 μg·kg-1）>牛粪（1 207.12 μg·kg-1）>猪粪（268.84 μg·kg-1）。选用的三种粪便中雌激素活性较高，对周围环境存在一定威胁，应引起重视。EE2的活性当量系数为8.71，具有很高的活性，使用含有EE2的药物、饲料，将大幅度增加畜禽粪便中雌激素的活性。
2.2 堆肥过程中畜禽粪便雌激素含量变化三种粪便堆肥32 d雌激素残留率变化如图 1所示。鸡粪中E3、17β-E2、EE2在堆肥32 d残留率为10.0%、45.5%、6.7%，EE2和E3降解速率大于17β-E2。而猪粪中17β-E2、E3在堆肥32 d时残留率分别为8.8%和36.3%，17β-E2降解速率大于E3。牛粪中17β - E2、EE2在堆肥16 d时残留率分别为9.7%、12.6%，降解速率相差不大。三种畜禽粪便堆肥过程中堆体温度及总雌激素残留率变化如图 2所示。三种堆体的温度在堆肥第3 d均达到50 ℃以上，维持到第16 d之后开始下降，逐渐接近环境温度。根据《粪便无害化卫生标准》（GB 7959—2012）规定，堆肥温度大于等于50 ℃并维持10 d以上，才能能够达到粪便无害化卫生标准。显然，本文中三种畜禽粪便经堆肥后均达到了无害化要求。在堆肥第2 d时，鸡粪、猪粪、牛粪中总雌激素残留率分别为90.1%、85.50%和70.7%，而第4 d残留率分别为63.3%、56.4%、30.7%，前2 d雌激素降解速率明显比较缓慢。鸡粪、猪粪在第16 d总雌激素残留率分别为33.7%、22.9%，而第32 d残留率分别为16.5%和14.6%，堆肥后16 d雌激素降解速率明显减缓。不仅总雌激素，17β-E2、E3和EE2均表现出阶段性变化（图 1），在堆肥前期雌激素降解缓慢，堆肥中期雌激降解较快，而后期降解速率又减缓。
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同一堆肥时间下不同字母表示各雌激素间差异显著（P＜0.05）。下同 The different letters at the same time indicate significant difference(P < 0.05). The same below 图 1 堆肥过程中鸡粪、猪粪和牛粪中雌激素残留率变化 Figure 1 Change of residual rate of estrogen in chicken, pig and cow manures during composting |
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图 2 三种畜禽粪便堆肥过程中堆体温度及总雌激素残留率变化 Figure 2 Change of pile temperature and residual rate of estrogen total in three livestock manures during composting |
堆肥32 d后，三种粪便中雌激素含量如表 3所示。鸡粪中17β-E2、E3和EE2含量分别为134.62、76.54、24.00 μg·kg-1，残留率分别为45.5%、10.0%和6.7%。猪粪中17β-E2、E3含量分别为22.17、24.27 μg·kg-1，残留率分别为8.8%和36.3%。而牛粪中17β-E2、EE2和BPA在堆肥32 d后均无残留。用17β-E2活性当量EEQ表征粪便中总雌激素的活性值，在堆肥32 d后，鸡粪、猪粪、牛粪的EEQ值分别为363.92、28.48、0 μg· kg-1，残留率分别为10.1%、10.6%、0。经过堆肥处理，三种粪便的总雌激素活性大幅降低，因此堆肥对降低雌激素污染具有较好的效果。
2.4 堆肥过程中翻堆频率对雌激素降解的影响本实验对牛粪堆肥进行了不翻堆、两日翻一次、一日翻两次处理，雌激素降解结果如图 3所示。在堆肥32 d，17β-E2在三种处理下残留率分别为29.5%、0、0。翻堆与不翻堆对17β-E2降解具有显著差异（P＜0.05），而两日翻一次和一日翻两次不具有显著差异（P>0.05）。EE2在堆肥32 d均降解完全，翻堆与不翻堆无显著差异（P>0.05）。BPA在堆肥32 d，在两个翻堆处理下均无残留，而不翻堆处理残留率仍高达58.1%，所以不翻堆与翻堆存在显著差异（P＜0.05），而翻堆频率对残留率无显著影响（P>0.05）。在不翻堆、两日翻一次、一日翻两次处理下牛粪中总雌激素在堆肥32 d残留率为15.4%、0、0，所以不翻堆与翻堆存在显著差异（P＜0.05），而翻堆频率对残留率无显著影响（P>0.05）。所以堆肥过程中翻堆有利于加快雌激素的降解，但增加翻堆次数并不能显著促进雌激素降解。
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图 3 牛粪堆肥过程中不同翻堆频率下17β-E2、EE2、BPA和总雌激素残留率的变化 Figure 3 Change of the residual rate of 17β-E2, EE2, BPA and total estrogens with different turning frequency during cow |
本研究三种畜禽粪便中均检测出高含量天然雌激素，三种畜禽粪便的17β-E2高于Xu等[7]报道的江苏省平均水平38.6 μg·kg-1，鸡粪中E3也高于平均水平289.8 μg·kg-1。而鸡粪和牛粪中还有人工合成雌激素存在，其中EE2对两者EEQ贡献率分别达86.2%、90.9%。因此，三种畜禽粪便存在较大的雌激素污染风险，需要引起足够重视，特别是人工合成雌激素。此外，目前畜禽养殖业污染物排放标准（GB 18596—2001）以及畜禽粪便还田技术规范（GB /T 25246—2010）均未涉及到雌激素指标。而欧盟关于污染物生态风险的安全系数设定，只针对水体中雌激素污染物设定了EEQ标准（1 ng·L-1）[16]。为强化雌激素污染监控和防治，在未来研究中有必要针对畜禽粪便中雌激素设定安全标准。
雌激素的种类、初始浓度、温度以及参与代谢的微生物种类都会影响雌激素降解[25-26]。曾庆玲[20]在活性污泥对17β-E2、EE2降解研究中发现，17β-E2降解速率远高于EE2。郑溪[17]通过外加雌激素进行单一雌激素堆肥中降解特征研究，发现17β-E2降解速率高于E3。而本研究结果显示，鸡粪中EE2和E3的降解速率均大于17β-E2（P＜0.05）。结合三种雌激素的初始浓度发现，EE2、E3的初始浓度分别为355.75、769.18 μg·kg-1，均大于17β-E2的297.29 μg·kg-1。同时，猪粪中17β-E2、E3初始浓度分别为252.00、66.88 μg·kg-1，17β-E2降解速率大于E3（P＜0.05）。牛粪中17β - E2、EE2初始浓度分别为109.14、126.00 μg · kg-1，两者降解速率相差不大（P>0.05）。以往研究体系采用单一雌激素，但在实际畜禽粪便中常同时检出多种雌激素，这些雌激素存在竞争降解。而本研究结果表明，在多种雌激素共存时，浓度显著影响了它们的降解速率。此外，本研究显示雌激素降解速率呈现阶段性变化，这种现象可能与堆体内微生物活动有关。因为堆肥过程中，雌激素可能发生挥发、水解、光解以及生物降解过程，但雌激素的蒸气压、溶解度非常小（表 1），挥发和水解作用对雌激素的损失影响很小。而刘敏[27]在研究畜禽粪便改良土壤中雌激素自然降解的影响因素时发现，黑暗和光照条件下雌激素降解并没有太大差异。而以雌激素为碳源的微生物代谢作用是堆肥过程中雌激素降解的重要途径[28-29]。堆体内微生物活动与堆体温度有关，堆肥过程中的温度变化主要分为4个阶段：升温、高温、降温以及冷却腐熟阶段[27]。在堆肥初期，堆体温度较低，微生物活动较弱，而3 d后堆体温度会升高到50 ℃以上，堆体内微生物代谢增强。雌激素作为碳源被快速降解，相比其他阶段具有较高降解速率。微生物代谢释放大量热量，高温维持到第16 d，所以雌激素快速降解持续较长时间[30]。随着堆肥的进行，微生物仅能利用有限的剩余养分进行新陈代谢，温度呈下降趋势。当堆体温度接近环境温度时，堆肥达到稳定腐熟。降温和冷却腐熟阶段，微生物活动较弱，雌激素降解减缓。刘敏[27]和梁东丽等[31]在做鸡粪、猪粪、牛粪堆肥实验时，均发现三种畜禽粪便在堆肥过程中温度变化基本呈现相似趋势，并无太大差异。
多数规模化养殖场对清理的粪便通常采用短期内简单堆置后施用到农田的处理方法。Zheng等[6]报道，新鲜牛粪17β-E2含量为153 μg·kg-1，自然放置14 d后残留率为24.18%。刘敏等[3]将牛粪、猪粪、鸡粪投放到土壤中，自然降解8 d后E2残留率分别为50.08%、58.84%、54.92%。本研究中新鲜猪粪、牛粪中17β-E2含量为252.00 μg·kg-1和109.14 μg·kg-1，在堆肥8 d时残留率为22.2%和27.4%，堆肥16 d残留率为13.7%和9.7%，优于Zheng等[6]和刘敏等[3]的自然放置和直接施加到土壤的结果。鸡粪中17β-E2在堆肥8 d和16 d时残留率为70.1%和61.7%，相对较高，主要因为鸡粪中还含有较高含量的E3和EE2，两者会与17β-E2竞争降解。而刘敏等[3]将牛粪、猪粪、鸡粪与树叶混合，放入培养箱中模拟堆肥实验，获得了相似结果。在堆肥第14 d，鸡粪和猪粪E2残留率均小于25%，牛粪中E2残留率也只稍大于25%。因此，畜禽粪便经堆肥处理，雌激素含量低于自然堆置和直接施加到土壤，堆肥有利于降低雌激素污染风险。
本研究在堆肥过程中对堆体进行两日一翻堆处理后发现，相比于不翻堆，堆肥32 d时BPA、17β-E2残留率分别由58.1%、29.5%降低到0、0。堆肥16 d时EE2降解数据显示，经过两天一翻堆处理，EE2残留率由20.0%降低到13.9%。因此，堆肥过程中通过翻堆可以提高雌激素降解速率。曾庆玲[20]研究城市污水中雌激素降解时，发现17β-E2降解速率常数在好氧条件下比厌氧条件下大15%左右，而EE2在好氧条件下比厌氧条件下大34%左右。张静等[32]采用河流底泥作为菌源降解BPA，发现BPA在厌氧环境中不能被降解，而在好氧环境中能够被彻底降解。Stanford等[33]对17β-E2、E3、EE2在奶牛粪便厌氧消化过程中的降解规律展开研究，结果发现雌激素在厌氧条件下的生物降解速率远低于好氧条件下。因此，通过对堆体进行翻堆处理可以增加堆体中氧气含量，好氧菌增殖迅速，从而提高了雌激素的降解效率[34]。但本研究中两日一翻堆和一日两翻堆处理的雌激素降解并无明显差异。主要因为翻堆频率过高，发酵中已升温的原料的散热量也增加，反而使发酵温度降低，不利于物料降解[35]。因此，要根据堆肥原料设定适合的翻堆频率来改善堆肥效果。
4 结论（1）三种畜禽粪便含有较高浓度的天然雌激素，鸡粪和牛粪还含有人工合成雌激素，而鸡粪、猪粪、牛粪的活性当量EEQ值分别为3 595.86、268.84、1 207.12 μg·kg-1，存在较大的雌激素污染风险。
（2）当畜禽粪便中多种雌激素共存时，雌激素降解受初始浓度影响显著，浓度高者具有较大的降解速率。雌激素降解速率随堆体内微生物活动发生改变，堆肥中期微生物活动最为活跃，雌激素降解速率高于堆肥前期和后期。
（3）在堆肥32 d，鸡粪、猪粪、牛粪EEQ残留率分别为10.1%、10.6%、0，堆肥处理很大程度上降低了雌激素污染风险。
（4）对牛粪堆肥进行翻堆处理，雌激素降解明显加快。因此，在堆肥基础上增加堆体内氧含量有利于提高堆肥效果。而两日一翻和一日两翻雌激素降解无明显差异，增加翻堆次数并不能显著提高堆肥效果。
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