有机肥又称农家肥，具有成分复杂、肥效长、养分全面等特点。农业生产中施用有机肥，可增加土壤肥力、提高作物产量和改善品质，其施用效果得到普遍肯定^[1-3]。随着人们对食品安全意识的提高，生态农业和绿色食品愈来愈受到重视，使得有机肥料的应用也越加广泛^[4]。有机肥料原料来源丰富，如人畜粪便、堆沤肥、污泥、绿肥、杂肥及各种垃圾等^[5]。近年来集约化禽畜养殖业快速发展，禽畜粪便成为有机肥主要来源^[6]。

雌激素是由动物体内细胞所分泌出来的一种化学物质，能够协调生物体各种生理过程^[7]。但排入环境中的雌激素会通过模拟、干扰机体内生激素原有的正常合成、运输和释放，使其无法维持自身的平衡和调节，可引起人类和动物的雌性化^[8-9]。作为雌激素重要来源之一的养殖业畜禽粪便，会携带大量的雌激素^[10-11]。通过施肥进入农业土壤，对环境、动物及植物等造成不良的影响，并最终会随食物链影响人类健康^[12]。有机肥料中雌激素污染状况及其施用的生态安全研究已刻不容缓。

鉴于畜禽粪便有机肥对土壤及生态环境存在的潜在危害，国内外已针对其中的重金属和抗生素污染展开大量研究^[13-15]，并对有机肥中各种污染物制定了一系列安全标准^[16-18]。但关于有机肥中雌激素污染鲜有报道，并且已有标准中没有具体指标涉及雌激素的残留问题。有关有机肥中雌激素的污染特征数据极度缺乏，市面上经生物发酵的有机肥中雌激素污染状况尚不明确。本文收集了17个畜禽粪便商品有机肥样品，检测了有机肥中雌激素的种类和含量，分析畜禽粪便制成的有机肥中雌激素的污染特征，为阐释有机肥中雌激素对环境的危害提供重要理论依据。

雌三醇（E3，98%）、17β-雌二醇（17β-E2，98%）、双酚A（BPA，99%）标准品均购自上海晶纯试剂有限公司，炔雌醇（EE2，99%）标准品购自美国Sigma公司。甲醇（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯）和乙腈（色谱纯）购自南京化学试剂股份有限公司。共收集商品有机肥样品17个，其中9个鸡粪有机肥样品、4个猪粪有机肥样品和4个牛粪有机肥样品。

采用《有机肥料》（NY 525—2012）对有机肥样品中有机质、氮、磷和钾等的测定方法进行检测。

采用SPE-HPLC/FLD法^[19-20]检测有机肥中雌激素含量。称取冷冻干燥并经粉碎机粉碎后过20目筛的（1.00±0.01）g有机肥样品，加入1.00 mL的雌激素（空白组加入等量的甲醇）混合标准溶液（1 mg·L^-1），混合均匀后放置12 h，再加入20 mL提取剂（乙酸乙酯），涡旋30 s后超声提取1 h，并以4000 r·min^-1离心30 min，取5 mL上清液通过C18固相萃取柱，用15.00 mL体积比为1:1的甲醇和乙酸乙酯混合液洗脱，洗脱液收集至小试管中。将小试管置于40 ℃的恒温水浴并用氮气缓慢吹干，然后加入甲醇溶液涡旋混合，将附着物重新溶解至2.00 mL，过0.22 μm孔径滤膜后，HPLC/FLD分析。色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS-SP-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇/乙腈/水（体积比为20:30:50）；流速1.00 mL·min^-1；柱温40 ℃；进样量20 μL；荧光检测器采用波长切换，切换方式如下，0~5.2 min激发/发射波长为300/450 nm，5.2~7.1 min激发/发射波长为280/310 nm，6.1~ 10.4 min激发/发射波长为300/450 nm，10.4 min~25.0 min激发/发射波长为280/310 nm。

不同畜禽粪便有机肥中主要营养物质含量如表 1所示。鸡粪有机肥、猪粪有机肥和牛粪有机肥中有机质均值分别为54.17%、59.02%和46.57%；N均值分别为1.85%、1.58%和1.55%；P₂O₅均值分别为7.96%、11.13%和7.52%；K₂O均值分别为2.10%、1.39%和2.34%。从表 1可知，所收集的17种有机肥样品绝大部分都满足《有机肥料》（NY 525—2012）中对有机肥的营养物质含量的要求：有机质≥45%，总养分（N+P₂O₅ + K₂O）≥5.0%。但有机肥样品中的鸡粪样品YH5、YH7、YH8，猪粪样品YS3以及牛粪样品YC3中有机质含量低于标准，未能达到有机肥质量要求，需要加强质量监管力度。

表 1 Table 1

表 1 畜禽粪便有机肥中主要营养物质含量（%） Table 1 Main nutrients content in organic fertilizers from livestock manures(%)

表 1 畜禽粪便有机肥中主要营养物质含量（%） Table 1 Main nutrients content in organic fertilizers from livestock manures(%)

各种脊椎动物雌激素的排放种类和排放量因动物种类、生长阶段、年龄和性别差异而不同^[21-22]，本文选择了普遍存在的天然雌激素E3、17β-E2以及合成雌激素BPA、EE2进行研究。采用SPE-HPLC/FLD法对有机肥样品中E3、17β-E2、BPA和EE2进行检测，结果如表 2所示。有机肥样品YH2、YH5、YH7、YH9、YS1、YS4、YC2、YC3、YC4未检测到雌激素，其余8个有机肥样品均有不同含量的雌激素被检出。有机肥中雌激素含量范围和均值如表 3所示，E3、17β-E2、BPA和EE2的含量（干质量计）范围分别为ND~2 417.34、ND~167.34、ND~514.91 μg·kg^-1和ND~186.97 μg·kg^-1。E3、17β-E2、BPA和EE2的均值（干质量计）分别为298.52、11.28、54.24 μg·kg^-1和11.00 μg·kg^-1。说明市场上畜禽粪便有机肥中部分产品含有雌激素，并且含量较高，这种产品施加到农田土壤将造成一系列安全隐患。所以，在售卖、使用畜禽粪便有机肥前，应对雌激素进行检测，并制定安全标准。而四种雌激素中E3的含量远高于17β-E2、BPA和EE2三种雌激素，表明有机肥中E3相对于其余三种雌激素存在较大的污染风险。因此对于畜禽有机肥需重视E3的潜在污染风险，同时不能忽视17β-E2、BPA和EE2的污染风险。

表 2 Table 2

表 2 有机肥中雌激素含量（μg·kg-1） Table 2 The concentration of estrogens in organic fertilizers(μg·kg-1)

表 2 有机肥中雌激素含量（μg·kg-1） Table 2 The concentration of estrogens in organic fertilizers(μg·kg-1)

表 3 Table 3

表 3 有机肥中雌激素含量和均值（μg·kg-1） Table 3 The concentration of estrogens in organic fertilizers(μg·kg-1)

表 3 有机肥中雌激素含量和均值（μg·kg-1） Table 3 The concentration of estrogens in organic fertilizers(μg·kg-1)

将鸡粪、猪粪、牛粪有机肥中雌激素与此前研究^[11]中新鲜鸡粪、猪粪、牛粪中雌激素（表 4）进行比较。此前研究所用新鲜鸡粪、猪粪、牛粪样品采自南京附近各处养殖场，而本研究收集有机肥并不是由这些新鲜粪便制备。所以，有机肥中E3（298.52 µg· kg^-1）、17β-E2（11.28 µg·kg^-1）、BPA（54.24 µg·kg^-1）、EE2（11.00 µg·kg^-1）含量并未表现出明显比新鲜粪便中E3（218.95 µg·kg^-1）、17β-E2（42.83 µg·kg^-1）、BPA（43.44 µg·kg^-1）、EE2（19.84 µg·kg^-1）含量低的现象，而检出率相对于含量更具有对比意义。有机肥和新鲜粪便中雌激素检出率如图 1所示，鸡粪、猪粪、牛粪有机肥中四种雌激素的检出率均明显低于对应新鲜粪便。所有有机肥中E3、17β-E2、BPA、EE2检出率分别为47.06%、11.76%、17.65%、5.88%，而新鲜粪便中E3、17β-E2、BPA、EE2检出率则分别高达67.74%、70.97%、70.97%、58.06%，说明将新鲜粪便通过堆肥发酵制备有机肥能够使雌激素发生降解而含量降低^{[12, 23]}。但有机肥中雌激素检出率仍然较高，所以目前所用堆肥发酵制备有机肥工艺仍需改进。此外，牛粪新鲜粪便中雌激素含量和检出率相对鸡粪、猪粪较低，制备的有机肥中雌激素较易降解完全，所以牛粪有机肥中雌激素含量和检测率非常低。牛粪有机肥相对鸡粪、猪粪有机肥污染风险更小，更能满足环境保护的需要。

表 4 Table 4

表 4 新鲜鸡粪、猪粪、牛粪中雌激素的含量[11]（ μg·kg-1） Table 4 The concentration of estrogens in chicken, swine and cow fresh manures[11] (μg·kg-1)

表 4 新鲜鸡粪、猪粪、牛粪中雌激素的含量[11]（ μg·kg-1） Table 4 The concentration of estrogens in chicken, swine and cow fresh manures[11] (μg·kg-1)

图 1 有机肥和新鲜粪便中雌激素检出率 Figure 1 Detection rate of estrogens in organic fertilizers and fresh manures

（1）对采集的有机肥样品中有机质、全氮、全磷、全钾进行检测，发现并不是所有产品都能达到《有机肥料》（NY 525—2012）中对有机肥营养物质含量的要求。

（2）对采集的有机肥样品中雌激素进行检测，发现市场上畜禽粪便有机肥中部分产品含有雌激素，且含量较高，其中E3的含量远高于17β-E2、BPA和EE2，存在较大的污染风险。

（3）将有机肥中雌激素与新鲜畜禽粪便中雌激素进行对比，发现有机肥中四种雌激素检出率均明显较低，说明将新鲜粪便通过堆肥发酵制成有机肥能够使雌激素发生降解，从而降低污染风险，但有机肥中雌激素检出率仍然较高。此外，三种粪便制备的有机肥中，牛粪有机肥中雌激素含量和检出率更低，较为安全。