我国是农业大国，畜牧养殖业废弃物产生量巨大，若处理不当，其中的抗生素、重金属等有害元素会通过雨水淋溶、地下水扩散等作用，加重周边地区污染。据报道，畜牧养殖业可增加周边地区铜、锌、镉等重金属污染^[1-2]，且每年用于畜牧养殖业的抗生素超过8000 t^[3]。抗生素大部分为水溶性，使用后不能完全被动物吸收利用，约30%~90%的抗生素通过粪便和尿液排出^[2]，造成了很多负面效应，如：通过动物残留、作物吸收后进入食物链，在人体内蓄积，达到一定浓度后，造成急性或慢性中毒，导致恶心呕吐、过敏反应、激素分泌异常等，甚至对人体肝肾、淋巴细胞等造成伤害，影响人体健康^[5-6]；危害作物生长，对植物胚轴、根系、叶子的生长均有不同程度的抑制作用^[7-8]；影响环境微生态，降低微生物多样性和活性，产生耐药基因^[9-12]，可能导致含多重耐药基因的超级细菌产生，带来更严重的深远影响。

据报道，在畜牧养殖业废水、粪便和周边土壤中检出浓度最高的抗生素为四环素、喹诺酮类、磺胺类兽药抗生素，其浓度达到了μg·L^-1或mg·L^-1级别^[13-16]。这三类抗生素在土壤中都具有易吸附、难降解的共同特点^[17-19]，而微生物降解又是大部分抗生素在固相环境中降解的重要途径^[20-21]，但目前针对这些残留抗生素的微生物降解菌株的筛选研究，局限于单一类型抗生素^[22-24]，且筛选的菌株大多为细菌，在筛选和应用过程中，会导致某些敏感细菌群和抗生素抗性基因的形成和相互传递^[25-26]，使得某些致病菌变成多种抗生素耐药菌，造成不可估量的隐形环境污染。因此，本研究以目前畜牧养殖常用的3种抗生素——土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶为靶标物，为减少这3种抗生素抗性因子的传递，筛选鉴定出具有这3种抗生素降解能力的真菌，旨在为防治多种抗生素交叉污染、减少多重耐药基因产生和生产绿色安全农产品提供理论支持。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 仪器

高效液相色谱仪LC-20A，配有紫外检测器(UV)和二极管阵列检测器(DAD)，由日本Shimadzu公司制造；高速离心机由德国Eppendorf公司制造；PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统由德国Analytikjena公司制造，紫外分光光度计由北京恒通公司制造。

1.1.2 样品采集

采集四川省什邡双盛镇矿厂周边7个重金属污染土壤，重金属镉、锌、铜、铅含量均超过土壤环境质量标准三级上限。采集样品用无菌袋封装，-20 ℃保存备用。

1.1.3 培养基

无机盐培养基：(NH₄)₂SO₄ 2.0 g，K₂HPO₄ 0.5 g，NaH₂PO₄ 0.5 g，双蒸水(ddH₂O)1 L，pH 7.0~7.4，1×10⁵ Pa灭菌30 min。

驯化及筛选培养基：在灭菌后的培养基中，分别加入适量过滤除菌抗生素母液。

分离纯化培养基：马铃薯蔗糖培养基。

1.2 菌株富集驯化培养

称量10 g用四分法处理后的样品，分别以土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶浓度100 μg·mL^-1为起点，每100 μg·mL^-1为一个梯度，接种量为10%，7 d为一个周期，逐级增加抗生素浓度，进行富集驯化培养，培养温度30 ℃，转速150 r·min^-1。

1.3 菌株分离与纯化

吸取10 mL菌株富集驯化液，加入装有90 mL无菌水和适量玻璃珠的三角瓶中，150 r·min^-1充分振荡20 min作为母液菌悬液，进行常规梯度浓度稀释涂布，30 ℃培养3~7 d，将不同形态菌落挑出，进行分离纯化培养。

1.4 菌株降解抗生素能力测定 1.4.1 菌株培养

将分离纯化后的菌株斜面培养后，用无菌水将孢子洗脱下来，配制成1×10⁷ cfu·mL^-1的菌悬液，按10%接种量，接种到分别含有50、1500 μg·mL^-1土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶的无机盐筛选培养基中，每个重复3次，于30 ℃、150 r·min^-1振荡避光培养，为消除理化因素的影响，以含有相同浓度抗生素的培养液作为空白对照。菌株培养7 d后，检测发酵物中各抗生素含量，与空白对照相比计算降解率；取50 μg·mL^-1抗生素处理等体积培养物，用真空抽滤分离菌丝体，于60 ℃烘干至恒质量，计算生物量。

1.4.2 抗生素浓度测定

运用高效液相色谱法及紫外分光光度法进行3种抗生素含量测定。

样品预处理：为排除菌丝吸附抗生素对检测结果的影响，发酵物经超声破碎后，添加提取物进行纯化、洗脱、流动相溶解，供高效液相色谱法测定，其中，磺胺二甲嘧啶纯化工艺参见文献[27]；诺氟沙星纯化工艺参见文献[28]；土霉素纯化工艺参见文献[29]。

高效液相色谱进样条件：(1)磺胺二甲嘧啶进样条件为C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，粒径5 μm)，预柱YMG C18，柱温22 ℃，流动相为25%乙腈:水=1:3，流速1.0 mL·min^-1，进样量20 μL，检测波长270 nm；(2)诺氟沙星进样条件为C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，粒径5 μm)，预柱Kromasil C18，柱温22 ℃，流动相为35%甲醇:水=1:3，流速0.8 mL·min^-1，进样量20 μL，检测波长278 nm；(3)诺氟沙星进样条件为C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，粒径5 μm)，预柱Kromasil C18，柱温22 ℃，流动相为35%甲醇:水=1:3，流速0.8 mL·min^-1，进样量20 μL，检测波长350 nm。

土霉素紫外分光光度法检测条件参照文献[30]，诺氟沙星紫外分光光度法检测条件参照文献[31]，磺胺二甲嘧啶紫外分光光度法检测条件参照文献[32]。

1.5 菌株分类鉴定 1.5.1 菌株形态特征观察

对分离得到的菌株用PDA平板30 ℃培养7 d后，采用光学显微镜对菌落、菌丝和孢子等结构进行观察，并参照文献[33]进行鉴定。

1.5.2 ITS核苷酸序列扩增及测定

(1) 基因组DNA提取。液氮研磨法破壁后，取大约100 mg研磨物转自1.5 mL离心管中，用真菌基因组提取试剂盒进行菌株基因组DNA提取。(2)PCR扩增。ITS序列使用ITS1(5′ -TCCGTAGGTGAACCT⁃ GCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′)引物进行扩增^[34]。反应体系25 μL：10 × Buffer(Mg²⁺ free)2.5 μL，2.5 mmol · L^-1 dNTPs 2.0 μL，25 mmol·L^-1 MgCl₂ 1.5 μL，10 μmol·L^-1 ITS1和ITS4各1.0 μL，5 U·μL^-1 Taq酶0.3 μL，模板1.0 μL，ddH2O 15.7 μL。扩增反应条件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。(3)菌株鉴定。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，然后在GenBank中进行BLAST比对分析，并用MEGA 6.06软件Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发育树。

2 结果与分析 2.1 3种抗生素降解真菌的筛选结果

从采集的样品土样中，通过富集驯化，初筛得到30个具有土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶中一种抗生素降解能力的真菌分离物。将初筛获得的真菌分离物进行复筛，结果(表 1)表明，4株真菌分离物具有土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶中至少2种抗生素降解能力。并且，在各抗生素低浓度(50 μg·mL^-1)和高浓度(1500 μg·mL^-1)含量下，都具有一定的抗生素降解能力，随着抗生素浓度的增加，菌株对抗生素降解能力有不同程度的削弱。在抗生素浓度1500 μg· mL^-1条件下，菌株KS256具3种抗生素降解能力，与其他菌株相比其降解磺胺二甲嘧啶能力最强，降解率达到18.53%(与CK相比)。菌株KS272具两种抗生素降解能力，与其他菌株相比其降解土霉素及诺氟沙星能力最强，土霉素降解率达到40.29%、诺氟沙星降解率达到10.59%。各抗生素回收率通过加标法测定，加标样品为空白培养基及菌株各抗生素发酵液，测得回收率结果为91%~96%(表 2)，每个样品3个重复，平行实验结果确定了方法的可靠性。

2.2 菌株形态描述与鉴定

抗生素降解真菌KS248在PDA平板上28 ℃培养6 d形成圆形菌斑，菌落直径3.5~4.5 cm，菌落蛛网状，气生菌丝羊毛状，白色，菌落背面呈牵牛紫；KS256在PDA平板上28 ℃培养6 d形成圆形菌斑，菌落直径2.8~4.9 cm，菌落平铺，气生菌丝羊绒状，白色，基物表面肉色，基物不变色；KS257在PDA平板上28 ℃培养6 d形成圆形菌斑，菌落直径3~4 cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿色，背面无色；KS272在PDA平板上28 ℃培养6 d形成绒絮状菌斑，菌落表面榄灰色产孢层，菌落背面呈黄色(图 1)。菌株显微特征见图 2。

对4个菌株进行DNA提取、PCR扩增，得到的序列提交GenBank中进行BLAST，下载相似度较高的序列，用MEGA 6.06软件邻接法构建系统发育树(图 3)。如图 3所示，KS272与微紫青霉Penicillium janthinellum(KM268714)在同一分支上，相似性为99%；KS257与聚多曲霉Aspergillus sydowii(LT745389)在同一分支上，相似性为99%；KS256与腐皮镰刀菌Fusarium solani(JN222393)在同一分支上，相似性为99%；KS248与轮状镰刀菌Fusarium verticillioides(KC752592)在同一分支上，相似性为99%

结合菌株形态学特征，菌株KS272鉴定为微紫青霉Penicillium janthinellum(GeneBank Accession：MH045736)；菌株KS257为聚多曲霉Aspergillus sydowii(GeneBank Accession：MH045735)；菌株KS256为腐皮镰刀菌Fusarium solani(GeneBank Accession：MH045734)；菌株KS248为轮状镰刀菌Fusarium verticillioides(GeneBank Accession：MH045733)。

3 讨论

我国畜牧养殖规模小、较分散及多种抗生素使用，造成了畜禽抗生素污染物具有抗生素种类多、分布广、易累积扩散、环境生态风险大的特点。目前，国内外针对畜禽常用的土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶这3种抗生素物质造成的污染，筛选微生物降解菌进行治理，土霉素降解菌的研究较多，磺胺二甲嘧啶降解菌和诺氟沙星降解菌研究较少，且多数是针对低浓度抗生素的降解筛选，除少量降解土霉素的真菌外^{[22, 35]}，其他降解菌多为细菌类降解菌^[36-39]。但在现实的土壤环境，抗生素污染均为多种抗生素交叉污染，它们对环境的生态毒性相互叠加并互补，更加重了对土壤植物、土壤动物、土壤微生物的生态毒性，也加快了土壤环境微生物抗药性发展^[40-41]。而抗生素和某些重金属污染物，能共同作用形成复合污染物，对生态环境造成影响^[42]，重金属也可能降低抗生素的降解速率^[43]，且这3种抗生素都为广谱性细菌和部分放线菌抑制剂^[44]，如若筛选细菌作为这三类抗生素降解菌，会增加高抗药性基因产生概率，从而增加菌株使用的生态风险。因此，针对土壤多重高浓度抗生素治理，可减少多种抗生素生态毒性叠加，同时减少抗生素-重金属复合污染物的形成，杜绝多种抗性基因及超级细菌的形成和传播。本研究选取了3种使用量较大的畜牧用抗生素为研究对象，综合考虑到抗生素污染的多样性、菌株使用的普适性、菌株对环境的生态友好性及极端环境的适应性，选取重金属污染土壤进行采样，对多种抗生素污染联合修复微生物的筛选进行了探索，在土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶初始浓度为50 μg·mL^-1和1500 μg·mL^-1的条件下，筛选到4株具有多种抗生素降解功能的真菌。这对畜禽粪便累积区多种抗生素交叉污染治理，抗生素-重金属复合污染物的防治具有较强的现实意义，今后还应对抗生素降解菌的使用进行环境生态评估，真正实现抗生素无害化处理。

4 结论

(1) 在抗生素-重金属复合污染土壤中，对3种农用抗生素微生物修复种质资源进行了筛选，选育到4株抗生素降解真菌，均具有至少2种抗生素降解能力。

(2) 菌株对3种抗生素降解率从高到低依次排序为土霉素>诺氟沙星>磺胺二甲嘧啶，这可能与抗生素自身结构有关。

(3) 为使所筛菌株的应用具有普适性，测定了菌株在低、高浓度抗生素情况下对抗生素的降解率，随着抗生素浓度增加，菌株对不同抗生素降解能力有不同程度的削弱。