2018, Vol. 35
土壤微生物通过驱动土壤有机质分解、养分转运以及温室气体排放等过程，在全球生态系统功能调节中发挥重要作用[1-4]。农田生态系统中土壤微生物在推动土壤有机质和养分循环的同时还加工土壤中原有的或外源加入的营养物质，使其转化为可被植物吸收利用的形态，因而对土壤肥力的提高具有重要作用[5]。土壤微生物的活性、数量、种群和群落结构受多种外界因素的影响，能够敏感且及时地反映或预测土壤质量的变化趋势，可用作土壤肥力评价的生物指标[6-8]。
农田生态系统中土壤微生物（土壤细菌约占其总量的70%~90%）的分布状况及其影响因素正成为农业生态学和土壤微生物生态学领域的研究热点[9-14]。Oritz-Cornejo等[15]通过培养试验结果证明养分管理措施对农田土壤微生物群落结构有显著影响。万水霞等[16-17]研究表明，紫云英还田条件下长期配施化肥显著提高了双季稻区稻田土壤微生物量。袁红朝等[18-19]研究发现，长期施肥的稻田土壤细菌16S rRNA基因数量可达到每克干土5.8×109~1.06×1010个拷贝数，施肥后，细菌和古菌的多样性和数量显著增加。Chelsea等[20]使用Meta分析发现施用氮肥能显著提高氨氧化细菌（AOB）的丰度及数量，从而增加土壤硝化潜势。
紫云英作为一种冬季绿肥，因其可以培肥土壤和固定大气中的氮素在南方稻田中广泛使用。但是，目前对紫云英还田并施加氮肥后对土壤微生物效应的研究主要侧重于土壤微生物数量和有关酶活性变化等方面[21-22]，对于紫云英还田后施不同水平氮肥将如何影响湖南双季稻区稻田土壤细菌丰度及其群落结构变化的研究鲜见报道。本研究以湖南省双季稻区不同施肥处理耕层土壤为研究对象，以16S rRNA基因为分子标靶，借助Illumina MiSeq高通量测序平台和荧光定量PCR技术，探讨冬种紫云英还田后不同施氮水平对双季稻田土壤细菌群落结构和丰度的影响，以期为指导农田施肥和优化种植制度提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验地概况田间试验于2008—2017年在湖南省华容县长江大学试验基地（东经112°55′，北纬29°52′）进行。当地气候为亚热带季风湿润气候，年均气温16~18 ℃，≥10 ℃积温5000~5800 ℃，无霜期260~310 d，年降雨量1200~1700 mm。试验土壤为长江沉积物发育的紫潮泥水稻土。试验前土壤肥力指标：pH 7.7，有机质含量49.2 g·kg-1，全氮含量3.11 g·kg-1，碱解氮273 mg·kg-1，有效磷16.4 mg·kg-1，速效钾69 mg·kg-1。
1.2 试验设计试验采用冬种紫云英还田-早稻-晚稻的种植模式，共设4个处理：紫云英还田+施氮肥200 kg·hm-2（CN200）、紫云英还田+施氮肥100 kg·hm-2（CN100）、紫云英还田不施氮肥（CN0）、冬闲水稻不施氮肥（CK）。每个处理重复3次，小区面积30 m2。
1.3 样品采集于2016年3月，紫云英盛花期采集0~10 cm耕作层土壤样品，每个小区随机取5个点，剔除石砂和植物残渣等杂物，混合均匀后储存于封口袋中，一部分迅速用锡箔纸包裹放进液氮中，带回实验室-80 ℃冷藏，用于土壤微生物群落分析；另一部分土壤样品装入自封袋后带回实验室，置于4 ℃冰箱，鲜土样测定铵态氮和硝态氮含量，剩余土壤自然风干后测定土壤pH、有机质和全氮含量。
1.4 土壤理化性质测定土壤pH用酸度计法测定（土水比1:2.5）；铵态氮用2 mol·L-1 KCl浸提-靛酚蓝比色法测定；硝态氮用双波长紫外分光光度法测定；碱解氮采用碱解扩散法测定；有机质（SOM）用重铬酸钾容量法测定；全氮（Total N，TN）和全碳（Total C，TC）用元素分析仪（Costech ECS 4024 CHNSO，NC Technologies，意大利）测定。
1.5 土壤总DNA提取、PCR扩增及测序使用DNA试剂盒（MOBIO Laboratories Inc.，Carlsbad，CA，美国）从0.25 g土壤中提取总DNA。总DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，提取DNA的浓度和纯度（A260/280）用NanoDrop ND-1000分光光度计检测（Thermo Scientific，Rockwood，TN，美国）。使用Illumina MiSeq高通量测序平台进行扩增和测序，选择16S rRNA基因V4区338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′）和806R（5′ - GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′）为测序引物，两端引物都加有Barode序列标签（12mer）。PCR扩增体系条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s共30个循环，50 ℃ 30 s，延伸时间72 ℃ 1 min，72 ℃ 6 min。
1.6 荧光定量PCR使用ABI 7500（ABI，美国）实时荧光定量PCR系统测定细菌16S rRNA基因拷贝的丰度。反应体系：FastFire qPCR PreMix 10 μL，正向引物338F（5′ - ACTCCTACGGGAGGCAGCA - 3′）0.6 μL，反向引物806R（5′ -GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′）0.6 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，1 μL DNA，补加ddH2O至20 μL。程序扩增：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s共40个循环，延伸时间55 ℃ 1min。
1.7 数据分析数据去杂方法和参数：过滤read尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的read；将核苷酸相似度大于97%的序列作为一个OTU（可操作分类单位），共得到7069个OTUs，并进行单样品α多样性分析。采用RDP-classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行注释，得到每个OTU的分类学信息。统计各个样品含有OTU情况及每个OTU中含有序列的数目。利用Mothur软件在相似水平97%上进行Chao、Ace和Shannon指数的评估。数据方差分析和相关性分析用SPSS 20.0软件完成，由Origin Pro 2017软件制图。
1.8 多样性指数群落生态学中研究微生物多样性，通过单样品的多样性分析（Alpha多样性）可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括用一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。Chao：是用Chao算法估计样品中所含OTU数目的指数，Chao在生态学中常用来估计物种总数，由Chao在1984年最早提出。Ace：用来估计群落中OTU数目的指数，由Chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao的算法不同。Shannon：该指数值越大，说明群落多样性越高。Simpson：指数值越大，说明群落多样性越低。Coverage：是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。使用MiSeq测序技术对16S rRNA基因测序，4个样品共得到原始序列89 440条，样品含有序列条数18 513~27 093，OTUs数为1696~1838，样品测序覆盖度为98.26%~99.02%（表 1）。由稀释性曲线可以看出此测序深度获得序列数据量可以反映土壤样品总细菌生物信息（图 1）。
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表 1 样品测序结果及多样性指数 Table 1 Sequencing results and diversity indices of different soil samples |
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图 1 不同土壤样品OTUs的稀释性曲线（相似度97%） Figure 1 Rarefaction curves of the OTUs number at 97% similarity for different soil samples |
由表 2可知，不同处理土样有机质和铵态氮均有显著差异（P < 0.05）。CN100处理土壤有机质含量最高，各处理有机质含量大小为CN100>CN200>CK>CN0；CN0处理土样铵态氮含量最高，次之为CN200，CN100和CK处理的铵态氮含量（13.66 mg·kg-1和10.75 mg· kg-1）小于CN0和CN200处理（44.12 mg·kg-1和41.28 mg· kg-1）。CN100与CK、CN200与CN0两两之间的pH无显著差异（P>0.05）。CN200和CN100全氮及碳氮比无显著差异（P>0.05）。CN200处理的硝态氮显著高于其他3个处理，CN100处理土样硝态氮含量最低且显著低于其他3个处理（P < 0.05），CN0和CK之间硝态氮含量无差异（P>0.05）。
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表 2 不同施肥处理土壤基础化学性质（平均值±标准差，n=3） Table 2 Soil chemical properties of different N fertilizer application rate treatments(mean±SD, n=3) |
以16S rRNA基因为靶标，用荧光定量PCR测定土壤总细菌。结果显示，冬种紫云英还田后施不同水平氮肥时土壤总细菌数量在1.25×108~8.47×109拷贝数·g-1干土（图 2）。CN200处理土壤总细菌数量显著高于其他3个处理，CN100、CN0及CK土壤总细菌数量无显著差异（P>0.05）。相关性分析表明，土壤总细菌数量与硝态氮和碱解氮有显著正相关关系（r分别为0.663和0.978，n=12，P < 0.05），与pH值呈显著负相关关系（r=0.950，n=12，P < 0.05）。
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图中不同字母表示处理间差异显著（P<0.05） The different letters on the bar show the significant difference among treatments(P<0.05) 图 2 不同施肥处理细菌16S rDNA基因拷贝数 Figure 2 Abundance of bacterial 16S rDNA gene copies under different fertilizer application rate treatments |
采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平上统计各样本的群落组成，把无法分类的序列定义为无法归类。样品获得的16S rRNA基因OTUs在分类学门、科和属水平上可归类比例分别为95.08%、65.73%和61.52%。样品获得的OTUs归类在42个门、87个纲、157个目、241个科和323个属中，其中所有样品共有门、科和属数分别为38、213和284。
本试验依据样品群落结构分析，生成了不同样品间细菌群落结构柱状图（图 3），该柱状图反映了样品门水平上的类别和样品各细菌群落的相对丰度两个信息。在门水平上变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）是3个主要类群，分别占总OTU比例的42.22%~54.54%、8.56%~20.73%、10.98%~15.08%。CN100土壤样品中变形菌门（Proteobacteria）相对丰度低于CN200、CN0和CK处理；同时其绿弯菌门（Chloroflexi）相对丰度分别是CN200、CN0和CK的2.26、1.58倍和1.17倍；CN100中硝化螺旋菌门（Nitrospirae）的相对丰度低于其他处理，CK次之，CN200丰度最高。
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图 3 不同施肥处理的土壤细菌在门（a）和属（b）分类水平下的群落结构组成 Figure 3 The bacterial community structure at the Phylum(a)and Genus(b)classification level under different fertilizer application |
在属水平上Anaerolineaceae-uncultured、硝化螺旋菌属（Nitrospira）和Sva0485_norank为3个主要类群，所有样品中平均丰度分别为12.37%、9.81%、4.42%。CN100处理的Anaerolineaceae-uncultured相对丰度低于其他三个处理，但其硝化螺旋菌属（Nitrospira）类群丰度分别为CN200、CN0、CK处理的1.64、1.17倍和1.63倍（图 3b）。
2.4 土壤细菌16S rRNA基因Venn图分析利用Venn图分析了土壤样本在不同的分类水平上的组成相似性。结果表明，在门水平上各处理没有独有的OTU（即没有特有的物种），共有的OTU数为38，CN200和CN0有2个共有的OTU，CN100分别与CN0和CK各共有1个OUT（图 4a）。在属水平上CN200、CN100、CN0和CK分别有303、312、317、303个OTU。各处理共有的OTU数为284（物种），CN200和CK各特有1个OTU，CN100和CN0各特有2个OTU；CN200分别与CN100、CN0和CK共有295、301、290个OTU，CN100分别与CN0和CK共有308、296个OTU；CK、CN100和CN200共有285个OTU，CK、CN100和CN0共有294个OTU，CN100、CN200和CN0共有294个OTU（图 4b）。在种水平上CN200、CN100、CN0和CK分别有533、548、551、534个OTU。其中每个处理共有的OTU数目为491，各自特有的OTU数目分别为1、3、3、1；CN200与CN100、CN0及CK分别共有517、525、509个OTU，CN100与CN0和CK分别共有537、508个OTU（图 4c）。
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图 4 不同土壤样品土壤细菌16S rRNA基因在门（a）、属（b）和种（c）水平下OTUs组成Venn图 Figure 4 Venn drawing of 16S rRNA gene OTUs at the Phylum(a), Genus(b)and Species(c)classification level in different soil samples |
紫云英还田后不同施肥处理细菌16S rRNA基因拷贝数与土壤化学性质的Spearman相关性分析结果（表 3）显示，土壤铵态氮（NH4+-N）与细菌16S rRNA基因拷贝数有显著正相关关系，相关系数为0.790（P= 0.002），而其他6个土壤化学性质与细菌16S rRNA基因拷贝数无显著相关性。
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表 3 细菌 16S rRNA 基因拷贝数与土壤化学性质的 Spearman 相关性分析 Table 3 Correlation analysis between bacterial 16S rRNA gene copy number and soil chemical properties by Spearman |
对土壤中的优势菌群（门水平，相对丰度前12）和土壤化学性质进行Spearman相关性分析（表 4），在门水平下相对丰度前12的菌群与土壤总氮、碳氮比及全氮无显著相关关系。Proteobacteria（变形菌门）、Nitrospirae（硝化螺旋菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Chlorobi（绿菌门）、Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）、Latescibacteria、Firmicutes（厚壁菌门）在0.01水平上与土壤pH有显著负相关关系；Nitrospirae（硝化螺旋菌门）和Cyanobacteria（蓝藻门）在0.01水平上与土壤碱解氮存在显著负相关关系；Chloroflexi（绿弯菌门）、Chlorobi（绿菌门）、Parcubacteria在0.01水平上与土壤NH4+-N有显著正相关关系，Acidobacteria（酸杆菌门）和Latescibacteria在0.01水平与土壤NH4+-N有显著负相关关系，Nitrospirae（硝化螺旋菌门）在0.05水平上与其有正相关关系；Proteobacteria（变形菌门）、Nitrospirae（硝化螺旋菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Gemmatimonadetes（芽单胞菌门）和Latescibacteria分别在0.01和0.05水平上与土壤NO3--N有显著正相关关系。
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表 4 土壤优势菌群相对丰度（门水平）与土壤化学性质的 Spearman 相关性分析 Table 4 Correlation analysis between soil dominant bacterial community（Phylum level）and soil chemical properties by Spearman |
反映土壤总微生物活性的一个重要参数即土壤总细菌数量。此研究中稻田土壤总细菌16S rDNA基因在1.25×108~8.47×109拷贝数·g-1干土之间，与杨亚东等[23]和Shen等[24]研究发现的细菌数量109~1010拷贝数·g-1干土的数量级大体一致，但小于候海军等[25]、袁红朝等[18]和He等[26]得出的1010拷贝数·g-1干土的结果。万水霞等[27]研究发现紫云英还田能显著提高土壤微生物数量，颜志雷等[28]研究表明紫云英翻耕配施肥料能显著增加土壤细菌数量，曾希柏等[29]研究表明不同施氮量对土壤总细菌数量有显著影响，宋亚娜等[30]研究认为氮肥的施用能够使稻田土壤反硝化细菌的丰度显著提高，Tao等[31]研究发现施用紫云英绿肥可以显著提高土壤细菌数量和土壤质量。Wang等[32]研究发现长期施用无机肥会导致可操作分类单元（OTU）的丰度降低并影响土壤细菌中固氮菌的丰度和土壤细菌群落结构。Zhong等[33]研究表明长期施氮肥能使土壤理化性质改变而最终导致土壤微生物群落结构和部分微生物活性改变。
王聪等[34]研究发现在cDNA和DNA水平上，采用不同施肥方式对土壤细菌丰度的影响趋势是一致的，在平衡施肥的基础上进行秸秆还田均增加土壤细菌的数量。李卉等[35]和兰木羚等[36]研究表明，秸秆和绿肥还田可显著提高土壤微生物量碳和微生物量氮以及土壤微生物的物种丰富度指数和优势度指数。本研究CN200、CN100、CN0和CK处理的Chao指数分别为1906、2040、2003和1947。CN100和CN0高于冬闲CK，表明紫云英还田能提高土壤总细菌物种数；CN100处理高于CN0，表明紫云英还田后配施100 kg·hm-2氮肥比还田后不施氮肥更利于总细菌物种数增加；CN200处理显著低于CK，表明紫云英还田后配施200 kg· hm-2氮肥与冬闲相比虽然能提高土壤总细菌数目但是并不能增加土壤中物种总数，原因可能是大量的氮肥施入使得部分与氮素含量有关的细菌物种活度增加，而致使其他土壤细菌物种减少。冬闲处理的Shannon指数大于CN0和CN200，原因可能是冬闲土壤多年未被人工耕作和施入化肥，土壤结构未被影响，细菌多样性在这样的条件下得到维持和提高。
3.2 冬种紫云英还田后配施氮肥对稻田土壤总细菌群落结构的影响通过对紫云英还田后配施氮肥不同处理的12个优势菌门分析发现，变形菌门、绿弯菌门和硝化螺旋菌门是门水平上的3个主要类群，分别占总OTU比例的42.22%~54.54%、8.56%~20.73%和10.98%~15.08%。优势菌群为变形菌门，这一结果与国内外关于土壤细菌多样性的很多研究[37-38]相一致，变形菌门也是目前世界公认的最普遍的菌门[39]。高圣超等[40]研究发现，在大豆连作条件下不同施肥处理土壤细菌中，变形菌门、放线菌门和酸杆菌门是土壤中相对丰度最高的3个菌门。高雪峰等[41]研究发现在草原生态系统中土壤优势菌群为变形菌门、放线菌门和厚壁菌门）。袁红朝等[18]研究表明不同施肥水平下稻田土壤中，除变形菌门和放线菌门外，绿弯菌门也在农田土壤中占绝对优势。CN100处理的绿弯菌门的相对丰度高于另外两个处理和对照，说明冬种紫云英还田后配施合理量的氮肥可以改变稻田土壤细菌结构。Michie等[42]研究表明，长期施用有机肥和无机肥能提高植物根系的生理活性，促使根系分泌物增加，促进土壤微生物繁衍及生命活动，显著提高与根系分泌密切相关的变形菌门的丰度，多数研究认为变形菌门的丰度与碳的利用方式有关[43]。长期氮磷钾配施和紫云英还田显著影响土壤pH值和土壤肥力，使对生境变化较敏感的微生物种群丰度发生显著变化。本研究紫云英还田后配施100 kg·hm-2氮肥使得变形菌门丰度下降和绿弯菌门丰度上升的原因还需要进一步试验研究。
3.3 土壤理化性质对土壤细菌群落结构的影响研究发现土壤中的细菌群落主要受到土壤中铵态氮含量、pH值和土壤微生物量氮含量的影响，土壤细菌数量与土壤有效氮、速效钾、速效磷含量有显著正相关关系[9, 27]，袁红朝等[18]发现稻田土壤细菌群落与土壤中的铵态氮含量显著正相关。杨亚东等[23]通过研究氮肥对土壤总细菌的影响发现，小麦土壤总细菌数量只与土壤硝态氮有显著负相关关系，这与本研究稻田土壤总细菌数量与土壤铵态氮在0.01水平上有显著正相关关系的结论不一致。原因可能是不同覆盖作物的根系分泌物有差异，且取样时间和深度不同（本实验在3月份紫云英开花季取0~10 cm的土壤，杨亚东等[23]在7月和8月燕麦拔节期和成熟期取耕层0~20 cm的土壤）导致土壤理化性质差异。紫云英还田后施200 kg·hm-2氮肥（CN200）的土壤总细菌数量显著高于另外三个处理，紫云英还田后施100 kg·hm-2氮肥（CN100）的土壤总细菌数与还田不施氮（CN0）和冬闲（CK）无显著差异。CN100处理的pH值显著大于CN200和CN0处理，与CK相似；其铵态氮含量低于CN200和CN0处理，与CK处理相近；硝态氮含量显著低于其他三个处理。农田土壤细菌丰度和群落结构受多种因素影响。不同水分管理制度使稻田土壤氧化还原电位、pH值、土壤无机氮含量、土壤微生物量碳含量、土壤微生物量氮含量、可溶性有机氮含量和可溶性有机碳含量等出现差异，这些因素都可能导致土壤细菌的丰度和群落结构产生差异[44-47]。
4 结论本研究对冬种紫云英还田后配施氮肥条田下稻田土壤细菌数量和结构多样性进行研究，结果发现，在冬种紫云英还田条件下施氮肥会导致稻田土壤pH值降低，并改善其他土壤化学性质，施氮量增加显著提高土壤总细菌数量，改变稻田土壤细菌群落结构。
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