水稻是我国单产最高、种植面积最大、总产最多的粮食作物，全国约有60%左右的人口以稻米为主要食物^[1]。水稻在我国粮食生产中占有非常重要的地位，与国计民生密切相关^[2]。我国农业生产过程主要依赖化学肥料，但是随着化肥的过量使用，农作物品质下降、环境污染、土壤质量恶化等问题日趋严重^[3]，严重影响我国农业的可持续发展。随着科技进步，肥料的发展已趋于规范化、环保化、高效化和多功能一体化^[4]，新型微生物肥料的产生标志着肥料产业进入了一个新的里程^[5]。微生物肥料是指一类含有活的微生物并在使用中能获得特定肥料效应，从而增加植物产量或提高品质的生物制剂，其中最主要的微生物为根际促生菌^[6]。

植物根际促生菌(PGPR)是生活在土壤或附生于植物根系，促进植物营养吸收与生长，并能够抑制有害生物的有益微生物^[7-8]。PGPR是微生物肥料重要的种质资源，在生态环境保护、绿色有机食品生产以及农业可持续发展中发挥着重要作用^[9]。根际促生菌的种类及其功能较多，其中主要种类包括芽孢杆菌属(Bacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas)等，能合成生长素、赤霉素等促进植物细胞生长、分裂和分化、调节生根等对植物生长发育有直接作用功能的物质，还可改变土壤中钾、磷等元素的形态，使之有效化而利于植物吸收^[10]。研究发现能产生吲哚乙酸(IAA)、含铁细胞等物质的菌株，接种于植物并种植后，植物的根长、根鲜重、茎鲜重、根干重、茎干重、叶片数、总生物量均有不同程度的增加^[11]。近几年我国关于微生物肥料的研究呈现出增长趋势^[12]，但是北方土壤中根际促生菌的研究较少。本研究从黑龙江省水稻根系土壤中筛选和鉴定了水稻根系促生菌，研究其植物激素分泌和养分活化能力^[13]，为水稻专化型微生物肥料开发利用提供技术支持。

于黑龙江省二九零农场(47°35′23.85″ N，131°56′24.01″ E)水稻种植区，选取一片全部为黑土水稻田，此水稻田种植的水稻品种为龙粳46。在1 hm²范围内，随机选取10个点，每个点选取10株水稻，采用抖土法收集根系表面1~2 mm处的土壤约10 g，共计约100 g土壤，于4 ℃冷藏保存待用。

LB培养基(1 L)：琼脂20 g，酵母5 g，NaCl 8 g，蛋白胨10 g，pH 7.0；液体培养基不加琼脂。

PKO无机培养基(1 L)：葡萄糖10.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，(NH₄)₂SO₄ 0.5 g，NaCl 0.3 g，Ca₃(PO₄)₂ 2.0 g，KCl 0.3 g，MnSO₄·H₂O 0.03 g，FeSO₄·7H₂O 0.036 g，琼脂20 g；液体培养基不加琼脂。

蒙金娜有机培养基(1 L)：葡萄糖10.0 g，(NH₄)₂SO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO₄·7H₂O 0.03 g，MnSO₄·H₂O 0.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO₃ 1.0 g，酵母粉0.5 g，琼脂20.0 g；液体培养基不加琼脂。

亚历山大罗夫培养基(1 L)：蔗糖5.0 g，Na₂HPO₄ 2.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，CaCO₃ 0.1 g，FeCl₃·6H₂O 0.005 g，钾长石粉1.0 g，琼脂20.0 g，液体培养基不加琼脂。

MKB培养基(1 L)：酪蛋白氨基酸5.0 g，甘油15.0 mL，K₂HPO₄ 2.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，琼脂20.0 g，pH 7.0；液体培养基不加琼脂。

称取根系土壤1 g，无菌条件下于三角瓶中配制成土壤悬液，在25 ℃温度下140 r·min^-1振荡培养30 min得到土壤悬液。通过浓度梯度稀释，得到10^-4、10^-5、10^-6浓度的悬液，分别吸取0.1 mL悬液平板涂布在PKO无机培养基(溶磷菌筛选)、蒙金娜有机培养基(解磷菌筛选)、亚历山大罗夫培养基(解钾菌筛选)，每个处理3次重复，存放于28 ℃恒温箱内培养5 d。根据解磷圈、解钾圈和溶磷圈大小，在筛选培养基中分别挑取优势菌株，进行纯化和多次传代，每个菌株设置3个平行。将挑选的菌株分别接种于LB液体培养基中，在30 ℃温度下140 r·min^-1振荡培养过夜，吸取1 mL菌液于2 mL离心管中，4 000 r·min^-1离心10 min倒去上清保留沉淀，于-80 ℃冷藏备用。

针对挑选出的优势菌株进行16S rDNA测序，序列由上海美吉公司进行测定。菌株测序结果于NCBI中Blast比对，鉴定菌株。使用MEGA 5.0软件构建系统进化树，对其遗传性质进行分析。

将2 μg·mL^-1的磷标准液梯度稀释至含磷量为0.00、0.04、0.08、0.24、0.40、0.80、1.20 μg·mL^-1制作标准曲线。在室温下加入钼锑抗显色剂，显色20 min，测定其吸光值并制作标准曲线。测定标准曲线为y= 0.173 3x-0.116 6，相关系数R²=0.990 7。

将保存的溶磷菌株挑取少许沉淀接种于LB液体培养基中，在30 ℃温度下140 r·min^-1振荡培养过夜，使菌液吸光值OD₆₀₀=1，吸取1 mL菌液于液体PKO培养基；解磷菌株挑取少许沉淀接于LB液体培养基中，在30 ℃温度下140 r·min^-1振荡培养过夜，使菌液吸光值OD₆₀₀=1，吸取1 mL菌液于液体蒙金娜培养基，30 ℃温度下120 r·min^-1振荡培养箱培养。每24 h取5 mL菌液离心上清定容至25 mL后加入显色剂，每组3个平行，通过钼锑抗比色法测定菌株的溶磷与解磷能力^[14]。

将保存的解钾菌株挑取少许沉淀接种于LB液体培养基中，在30 ℃温度下140 r·min^-1振荡培养过夜，使菌液吸光值OD₆₀₀=1，吸取1 mL菌液于亚历山大罗夫液体培养基中，30 ℃温度下120 r·min^-1振荡培养，每24 h取样离心后利用火焰原子吸收光谱仪测定上清液中钾离子的浓度，每组3个平行，并绘制曲线^[15]。

标准曲线采用分析纯IAA进行制备，将200 μg·mL^-1的IAA标准液梯度稀释为0、25、50、75、100、125、150、175 μg·mL^-1浓度，采用Salkowski显色法测定吸光值(OD₅₄₀)。得到标准曲线为y=0.013 2x+0.011 1，相关系数R²=0.999。

将保存的菌株挑取少许沉淀接菌于LB液体培养基中，在30 ℃的温度下120 r·min^-1振荡培养24 h制作种子液，按1%的接种量将种子液分别接入含有200 mg·L^-1色氨酸的液体PKO无机培养基、蒙金娜有机培养基、亚历山大罗夫培养基中，于30 ℃温度下120 r·min^-1振荡培养，每24 h采用Salkowski显色法测量IAA分泌量，每组3个平行^[16]。

对菌株进行铁载体活性测定，将保存的菌株挑取少许沉淀接种于LB液体培养基中，在30 ℃温度下140 r·min^-1振荡培养过夜，使菌液吸光值OD₆₀₀=1，吸取1 mL菌液于MKB液体培养基中，在30 ℃的温度下120 r·min^-1振荡培养48 h，离心取3 mL上清液。将上清液与CAS检测液各3 mL均匀混合，每组3个平行，反应1 h，于630 nm处测定吸光值(As)。对照组为不接菌MKB液体培养基，测定方法同上(Ar)。铁载体含量测定根据公式：铁载体活性单位(%)=(Ar-As)/Ar×100进行计算铁载体产量^[17]。

将分析纯赤霉素溶于体积分数为70%的乙醇中，配制成100 μg·mL^-1的赤霉素标准液，梯度稀释为0、10、20、30、40、50 μg·mL^-1浓度，取各浓度的赤霉素溶液0.5 mL与4.5 mL 98%硫酸混匀后定容至20 mL测定吸光值(412 nm)，制作标准曲线，经测定得到赤霉素标准曲线方程y=0.021 9+0.000 2，R²=0.999。

将保存的菌株挑取少许沉淀接种于LB培养基中，30 ℃温度下120 r·min^-1振荡培养24 h制作种子液，按1%的接种量将种子液分别转接PKO无机培养基、蒙金娜有机培养基、亚历山大罗夫培养基中，30 ℃温度下振荡培养，每24 h离心取0.5 mL上清测定菌株赤霉素浓度，以确定各菌株最大赤霉素分泌量，每组3个平行^[18]。

应用SPSS 20.0软件对数据进行方差分析，并用Duncan新复极差法比较不同处理间各种指标之间的差异；相关数据统计分析和制图采用SigmaPlot 12.5软件进行。

提取筛选得到菌株的DNA，进行16S rDNA基因测序，菌株序列由上海美吉公司进行测定，并将测序结果在NCBI数据库中进行Blast比对，结果表明，解磷菌有Bacillus pumilus(LZP02)、Bacillus aryabhattai(LZP08)、Staphylococcus epidermidis(LZP10)、Bacillus ginsengisoli(LZP05)；溶磷菌有Bacillus megaterium (LZP03)、Bacillus oryzaecorticis(LZP04)、Bacillus ginsengisoli(LZP07)；解钾菌有Bacillus aryabhattai(LZP01)、Bacillus subtilis(LZP06)、Bacillus licheniformis(LZP09)。如图 1可见，各菌株的16S rDNA的基因序列构建系统进化树中，各菌株的分子鉴定结果经进化树比对可靠性较高且大部分菌株的亲缘关系比较接近^[19]。鉴定的菌株中，只有LZP10属于Staphylococcus sp.，其他9个菌株均属于Bacillus sp.。

图 1 菌株进化树 Figure 1　Phylogenetic tree of strains

图选项

由于菌株Staphylococcus epidermidis LZP10对人体有致病性，所以不进行研究。测定功能性的解磷菌有Bacillus pumilus LZP02、Bacillus aryabhattai LZP08、Bacillus huizhouensis LZP05，溶磷菌有Bacillus oryzaecorticis LZP04、Bacillus ginsengisoli LZP07、Bacillus megaterium LZP03，解钾菌有Bacillus subtilis LZP06、Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus licheniformis LZP09。由图 2A可知，Bacillus aryabhattai LZP08号菌株培养24 h时培养基磷含量达最高值，此时磷含量31.48 mg·L^-1。Bacillus pumilus LZP02与Bacillus huizhouensis LZP05号菌株在72 h时培养基磷含量达最高值，此时磷含量分别为32.68 mg·L^-1和35.57 mg·L^-1。由图 2B可知，3株菌均在168 h时达到最大溶磷量，Bacillus megaterium LZP03号菌株最大溶磷量为311.1 mg·L^-1，Bacillus ginsengisoli LZP07号菌株最大溶磷量为293.39 mg·L^-1，Bacillus oryzaecorticis LZP04号菌株最大溶磷量为286.42 mg·L^-1。由图 2C可知，Bacillus subtilis LZP06号菌株钾离子含量为1.13 mg·L^-1，Bacillus aryabhattai LZP01号菌株钾离子含量为1.02 mg·L^-1，Bacillus licheniformis LZP09号菌株钾离子含量为0.89 mg·L^-1，3株菌都具有较好的解钾能力。根据菌株功能性测定结果，挑选出转化能力较好的Bacillus aryabhattai LP01、Bacillus pumilus LZP02、Bacillus megaterium LZP03、Bacillus huizhouensis LZP05、Bacillus subtilis LZP06、Bacillus ginsengisoli LZP07 6株进行分泌植物激素能力测定。

A和B表示可溶性磷含量变化；C表示不同处理钾离子含量 图中不同小写字母表示处理间差异达显著水平（P<0.05），下同 A and B indicate the concentration changes of soluble phosphorus; C indicates concentration of the potassium ion The different lower case letters indicate significant difference among the treatments(P<0.05).The same below 图 2 菌株功能性测定 Figure 2　Functional determination of the strains

图选项

由图 3A可知，根系促生菌普遍具有分泌IAA的能力，其中Bacillus subtilis LZP06分泌量最高为92.26 mg·L^-1，而Bacillus aryabhattai LZP01、Bacillus megaterium LZP03和Bacillus ginsengisoli LZP07也具有较高的IAA分泌量，分别为77.87、55.71 mg·L^-1和53.31 mg·L^-1，且经过多次传代产IAA特性稳定。

A表示各菌株IAA最大释放量；B表示各菌株赤霉素最大释放量；C表示各菌株铁载体活性 A indicates the maximum release amount of IAA from strains; B indicates the maximum release amount of gibberellins from strains; C indicates the iron carrier activity from strains 图 3 菌株分泌激素测定 Figure 3　Determination of hormone secretion of the stratins

图选项

将菌株接种于筛选培养基后测定赤霉素分泌量，由图 3B可知，赤霉素分泌量最高的为Bacillus subtilis LZP06号菌株，其分泌量为24.91 mg·L^-1，其余菌株分泌量在10.75 ~17.46 mg·L^-1。

通过铁载体活性测定发现(图 3C)，Bacillus aryabhattai LZP01铁载体活性为39.2%，Bacillus pumilus LZP02铁载体活性为25.59%，Bacillus megaterium LZP03铁载体活性为47.22%，Bacillus huizhouensis LZP05铁载体活性为64.44%，Bacillus subtilis LZP06铁载体活性为51.75%，Bacillus ginsengisoli LZP07铁载体活性为50.91%。其中铁载体活性最高的菌株为Bacillus huizhouensis LZP05。

水稻是我国主要的粮食作物，并且是我国种植面积最大的农作物，随着水稻种植面积的不断加大，化肥农药等污染越来越严重^[20]，从而导致土壤中养分不足、植株生长发育缓慢等现象^[21]。本实验从黑龙江水稻根际土壤处筛选得到解磷菌4株，溶磷菌3株，解钾菌3株，经过16S rDNA测序比对，鉴定大部分菌株为芽孢杆菌属。芽孢杆菌具有代谢快、繁殖快和生长能力强等特点，最快4 h增殖10万倍，并且体积比一般病源菌分子大4倍数，相比之下占据空间优势，抑制病原菌生长^[22]。芽孢杆菌的促生机制主要有提高植物根际养分的可利用性、产生植物激素类物质，还可以通过抑制病原物和诱导抗性来间接地促进植物生长^[23]。该菌属菌株在生物固氮、降解重金属和环境污染物等许多方面都有应用，具有多种生物学功能^[24]。

研究发现微生物也能够产生生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯等植物激素，它们对于植物的生长是必需的^[25]。低浓度的生长素有促进器官伸长的作用，还能促进RNA和蛋白质的合成，促进细胞的分裂与分化。赤霉素最显著的效应是促进植物茎伸长，也可促进禾本科植物叶的伸长和促进果实发育和单性结实。微生物可以分泌铁载体，促进植物光合作用、呼吸作用、物质和能量的代谢。对筛选菌株进行激素分泌能力分析结果表明，检测的6种菌株均能产生生长素、赤霉素，均具有合成铁载体的能力。根据研究发现微生物肥料中含有活的微生物，并且在使用中能获得特定肥料效应来增加植物产量或提高品质^[26]，在营养元素的转化、促进作物生长、拮抗土传病害和生态系统的平衡等方面起着重要的作用。通过对本试验结果与国内外研究现状比较，解磷菌中Bacillus pumilus LZP02和Bacillus huizhouensis LZP05解磷能力较强，并且在生长素与铁载体分泌量上普遍高于其他促生菌^[27]；溶磷菌中Bacillus megaterium LZP03、Bacillus ginsengisoli LZP07溶磷能力和激素分泌能力较其他试验菌株具有明显的优势^[28]；解钾菌中Bacillus aryabhattai LZP01和Bacillus subtilis LZP06解钾能力较好^[29]。说明筛选的菌株可以显著提升土壤中有效钾、有效磷的积累，促进水稻生长^[30]。综上所述，将芽孢杆菌用于微生物菌肥的研发，既可以有效促进植物生长，提高农作物产量；还可以减轻化肥农药对土壤的损伤，保护环境。本研究结果必将对水稻微生物肥料开发利用产生推动作用，在农业生产实践中产生经济效益、社会效益和生态效益。

本试验研究结果表明，黑龙江水稻根际土壤中根际促生菌主要为芽孢杆菌属菌株，这类菌株具有较好生物学活性与功能，具有很好的研究价值。综合分析试验结果发现，Bacillus megaterium LZP03、Bacillus huizhouensis LZP05和Bacillus subtilis LZP06有较好的溶磷、解磷、解钾效果，且具有较强分泌生长素、赤霉素、铁载体能力，说明这3个菌株具有较强植物促生能力，具有巨大的开发利用潜力。研究成果将为水稻微生物肥料的开发与生产提供了理论和技术支持。