农业与工业生产过程已经不可避免地导致了土壤的重金属污染。据2014年4月发布的《全国土壤污染状况调查公报》，中国土壤总超标率达16.1%，耕地土壤超标位点达到19.4%，镉、砷、铜等被鉴定为污染面积最广的重金属。这些基础数据表明我国土壤重金属污染形势非常严峻，重金属污染治理已经关系国计民生。

与耕地土壤污染相对应，农产品重金属超标的研究报道也引起了全社会的关注。以镉为例，郭爱珍等^[1]的调研结果表明我国广东、陕西和华北等地多个城市市售蔬菜出现不同程度的镉污染。Ke等^[2]的研究指出，我国产自重金属污染区域大米的镉超标率超过18%。2014年广州市食品药品监管局对湖南某地多批次大米质检结果更是引发了备受关注的湖南“镉大米”事件。因此，如何应对中国如此广泛的耕地镉面源污染是一个政府和民众都积极关注的问题。而中国地少人多、休耕压力大的特点决定了我们需要发展更容易结合农业生产实践、成本低廉且不造成二次污染的生物修复技术。

目前已经使用的生物修复材料既有大型植物，也有微生物如细菌和微型真菌等。超积累植物和细菌研究已经较多，而对于大型真菌的修复报道较少。本文在总结大型真菌重金属富集能力与机制的基础上，探讨了其在土壤重金属污染治理方面的应用前景。

大型真菌是具有大型子实体的一类真菌，泛指蘑菇。我国大型真菌资源丰富，截至2009年已发现可食用的大型真菌936种、23变种、3亚种和4变型^[3]。有些大型真菌表现出较强的重金属富集能力（表 1），某些食用菌如鸡油菌（Cantharellus cibarius）甚至可以不加选择地吸附重金属，且吸附量大。研究表明野生大型真菌富集能力强于栽培品种^[4]，并且其中的菌根菌能够明显提高寄主植物抵御重金属毒害的能力^[5]。但是由于野生菌无法进行人工栽培，因而应用普通可栽培食用菌修复污染土壤是当下的备选手段。主栽食用菌栽培技术相对成熟，栽培周期短，年生物量相对较高，且易于回收处理（回收处理成本较其他生物低70%~80%^[6]），这些特性为抗性绿色植物与微生物所不具备，成为当下极具发展潜力的修复方式。

表 1　大型真菌重金属积累差异部分代表性数据 Table 1　Bioaccumulation ability of heavy metals in various macrofungi species

表选项

可食用的大型真菌富集重金属最早是在蘑菇属（Agaricus）镉累积的研究中发现的^[7]。随后研究表明大部分食用菌都具有富集重金属的能力，并且这种能力远超于绿色植物。重金属超积累生物的现象和概念是在植物中首次发现并定义的^[8]。超富集植物重金属吸收能力一般在1 000 mg·kg^-1（对于Co、Cu、Cr、Pb和Ni）或10 000 mg·kg^-1（对于Mn和Zn）以上^[9]。对于大型真菌而言，重金属富集能力只要达到此临界含量标准，或者达到同基质下其他非超富集大型真菌的100倍以上，就可定义为超富集大型真菌^[10]。研究发现紫星裂盘菌（Sarcosphaera coronaria）对As（7 090 mg·kg^-1干重）^[11]、松果鹅膏菌（Amanita strobiliformis）对Ag（1 253 mg·kg^-1）^[10]、以及蛹虫草（Cordyceps militaris）对Zn（28 570 mg·kg^-1）^[12]超富集，并且蛹虫草（C. militaris）位居已报道的锌超积累生物的第3位。

越来越多的大型真菌被发现具有重金属富集能力。在相同环境条件下，草腐菌对Cu、Ag、Cd亲和力强，而木腐菌对Cr、Mg、Se和Pb有较高亲和力^[13]。Vetter^[14]调查发现蘑菇属（Agaricus）真菌、金针菇（Flammulina velutipes）、香蘑属真菌（Lepista nebularis）可明显累积As。牛肝菌属真菌（Boletusbadius）能高效累积Au、As和Cs，并储存在不同部位^[15]。羊肚菌（Morchella deliciosa Fr.）和黄伞（Pholiota adiposa）对Cr的富集能力很强^[16-17]，远高于灵芝（Ganoderma lucidum）。双孢蘑菇（Agaricus bisporus）子实体对Cu富集能力较强；香菇（Lentinula edodes）^[18]、长根菇（Oudemansiella radicata）^[19]子实体对Cd富集能力较强；木耳（Auricularia auricula）子实体对各重金属富集能力顺序为Cd>Cu≈Zn>Pb^[20]。凤尾菇（Pleurotus pulmonarius）、香菇（L. edodes）、金针菇（F. velutipes）、木耳（A. auricula）子实体对As、Cd、Hg都表现出明显富集作用，富集能力按上述顺序依次减弱^[21]。猪肚菇（Panus giganteus）菌丝体对Pb超富集，在菌丝生长未受明显抑制时，最大积累量约1 125.56 mg·kg^-1，对Mn（4 443.33 mg·kg^-1）也表现出较大的富集能力^[22]。双孢蘑菇（A. bisporus）、木耳（A. auricula）、糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）、香菇（L. edodes）、金针菇（F. velutipes）菌丝体对Pb富集能力呈依次减小的趋势^[23]。灵芝（G. lucidum）菌丝体对Cd耐受能力较强，最大耐受浓度达3 mmol·L^-1[24]。糙皮侧耳（P. ostreatus）菌丝体对Cd（最大3 450 mg·kg^-1）和Cr（最大10 350 mg·kg^-1）富集能力较强，富集量随重金属浓度的增加而增大，富集系数随重金属浓度增加呈现先增加后减小的趋势；子实体生物量及累积量在一定添加范围内随重金属添加量增加而增大，且对Cd的富集能力高于Cr^[25]，同时对Hg也有较大的富集能力，富集系数最大可达140^[26]。综合多种大型真菌对重金属的富集特性（表 1），子实体对几种非必需重金属的富集能力一般为Cd>Hg>As>Pb；各种大型真菌对Cd的富集能力：香菇>灵芝>长根菇>双孢蘑菇>凤尾菇>姬松茸>糙皮侧耳>金福菇；对As的富集能力：香菇>凤尾菇>姬松茸>金针菇，对As的耐受能力较差；大型真菌对Pb的耐受能力普遍偏高，猪肚菇（P. giganteus）菌丝最大耐受浓度可达3 000 mg·L^-1，香菇（L. edodes）子实体耐受可高于1 600 mg·L^-1，菌丝体对Pb的富集能力较强，姬松茸（Agaricus blazei）富集系数可达481，高于灵芝（G. lucidum）、金福菇（Tricholoma lobynsis），而子实体对Pb的富集能力较差，富集系数均小于1，并按灵芝（G. lucidum）、姬松茸（Agaricus blazei）、双孢蘑菇（A. bisporus）、木耳（A. auricula）、凤尾菇（P. pulmonarius）、香菇（L. edodes）顺序依次降低；大型真菌对Cr的耐受性也较强，羊肚菌（Morchella. deliciosa）耐受浓度可达700 mg·L^-1以上，富集能力按糙皮侧耳（P. ostreatus）、羊肚菌（M. deliciosa）、黄伞（P. adiposa）、灵芝（G. lucidum）顺序依次降低；香菇（L. edodes）、凤尾菇（P. pulmonarius）、金针菇（F. velutipes）、姬松茸（A. blazei）对Hg的富集能力相当。不同大型真菌对同种重金属的富集能力表现不同，同种大型真菌对不同重金属的富集能力也表现出一定的差异。不同研究相关结果存在一定的出入，可能菌种不同、试验条件不同等因素导致，所以开展更系统深入的研究是必要的。

大型真菌对重金属的能力富集不但表现出种属间的差异性，同一物种在不同的生长时期、不同的生长部位也表现出明显的差异性。

姬松茸（A. blazei）^[27-28]、灵芝（G. lucidum）^[29]在菌丝体阶段对Pb表现出明显的富集作用，而在子实体阶段对Pb的累积作用却不明显^{[18, 30]}，这与其他研究中报道的食用菌子实体对Pb不能明显富集结果是一致的^{[20-21, 28, 30]}。黄建成等^[30]、王小平等^[31]的研究表明，姬松茸（A. blazei）对As、Cu、Zn、Cd和Hg几种重金属也表现出菌丝富集能力大于子实体的现象，并且糙皮侧耳^[25]（P. ostreatus）、长根菇^[19]（O. radicata）中的也有同样的研究结果。可见不同生长时期大型真菌对同种重金属表现出不同的亲和能力。

同种大型真菌子实体不同部位重金属分布也是不均匀的。一般来说，菌盖浓度最大，菌柄最小^[32-33]。凤尾菇（P. pulmonarius）、双孢蘑菇（A. bisporus）、香菇（L. edodes）中，Fe和Cr几乎完全积累在菌盖中，而As、Zn在菌盖和菌柄均有分布^[33]。Cocchi等^[34]研究发现，绒盖牛肝菌（Xerocomus badius）中Pb、Cd、Ag、Cu等14种金属元素菌盖中浓度高于菌柄。Falandyse等^[35]对四孢蘑菇（Agaricus campestris）的研究指出菌盖中Ag的富集高于菌柄。牛肝菌（Boletusbadius）中Au优先积累在菌盖和菌柄，而As主要积累在子实层^[15]。在多种食药用菌中，Cd在子实层中富集浓度均大于菌盖和菌柄^{[30, 36-37]}。Garcia等^[38]研究发现，鸡腿菇（Copyinds comatus）中Pb主要累积在子实层中；在对姬松茸（A. blazei）中重金属分布情况研究结果显示，Cu、Zn、Cd、Hg、As从菌柄下部到上部、从菌盖中心到边缘重金属含量逐渐增加，而Pb在菌盖浓度小于菌柄浓度^[30-31]。

在重金属胁迫环境下，大型真菌存在多种应对途径（图 1）。Das等^[39]对鸡纵菌（Termitomyces clypeatus）Cr胁迫下扫描电镜（SEM）及红外光谱（FTIR）分析结果显示，细胞壁中多糖、蛋白所带的活性基团如氨基、羟基、羧基、硫酸基、磷酸基等可以与Cr离子反应生成不溶物，将其吸附在细胞壁上。Xu等^[40]研究也证明，绿藻（Chlorella miniata）表面的羧基、氨基和磷酸基团是络合Cr³⁺的主要官能团。而细胞壁对重金属离子的络合符合单分子层、表面络合模型^[40-42]。吴涓等^[43]对黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）Pb吸附机制研究发现，Pb²⁺可与细胞壁上的Ca²⁺、Mg²⁺发生离子交换，从而吸附在细胞壁上。

重金属（M）可通过离子交换或化学键结合（细胞壁蛋白或多糖上的活性基团如氨基、羟基、羧基、硫酸基、磷酸基等）富集在细胞壁上，也可通过胞外聚合物（EPS）如草酸、黑色素等聚集在细胞表面。M通过自由扩散或主动运输进入细胞，进入细胞的重金属可与一些蛋白如金属硫蛋白（MT）、富含半胱氨酸的蛋白（Cys-rich protein）结合为螯合形式存在，也可引起细胞氧化应激反应。Transporter为转运蛋白。UPS为泛素蛋白酶系统。表达量上调基因包括：细胞壁多糖合成基因[Exo-b-1，3-glucanase（exGS）、Glycosyltransferase（GTs）]、脂肪酸代谢相关基因[Phosphatidylserine synthase（PSS）]、氧化应激相关基因[Trehalose synthase（treS）、DyP-type peroxidase]、胞内物质运输相关基因[Vesicle trafficking sec1-like protein（Sec1-like）、predicted V-type ATPase]、硫化物代谢[Metallothionein（MT）]、DNA损伤相关基因[Alkylated DNA repair protein（AlkB）]、真菌发育相关基因[Hydrophobin 2（Hyd2）] Cell walls bind heavy metals(M) through ionic and chemical interaction. Cell walls contain carboxyl, phenolichydroxyl and amine groups which provide many potential binding or biosorption sites for metal ions. Fungal extracellular polymer substances(EPS) including oxalates and melanins absorb metal ions and form crystals or precipitations onto cell surface. Some macrofungi take more metals by active transportation. Macrofungi detoxify by metallothionein(MT) chelating metal ions and activating SOD, CAT, POD and GSH. The ubiquitin-proteasome system(UPS) can target misfolded proteins for degradation. Gene transcription involved in complex regulatory networks is activated in fungi in response to heavy metal stress. Upregulated genes:Exo-b-1, 3-glucanase(exGS), Glycosyltransferase(GTs), Phosphatidylserine synthase(PSS), Trehalose synthase(treS), DyP-type peroxidase, Vesicle trafficking sec1-like, protein(Sec1-like), predicted V-type ATPase, Metallothionein(MT), Alkylated DNA repair protein(AlkB), Hydrophobin 2(Hyd2) 图 1 大型真菌重金属富集机制概念图 Figure 1　Schematic representation of heavy metal intake of macrofungi

图选项

Pohong等^[44]研究冬虫夏草（Cordyceps sinensis）胞外聚合物（EPS）发现，EPS是一种分泌在胞外的多聚糖蛋白类复合物，以多糖为主，还有少量（2.3%~15.8%）其他物质。草酸是木腐菌在重金属胁迫下产生的一种重要的代谢产物，Jarosz-Wilkolazka等^[45]通过SEM、能量散射X-射线光谱（EDXA）及高效液相色谱（HPLC）探测到高重金属浓度下培养的云芝（Trametes versicolor）菌丝周围产生了非常有序的草酸钙、草酸锌和草酸钴晶体；Machuca等^[46]在云芝（T. versicolor）和茯苓（Wolfiporia cocos）胞外也发现有高水平草酸盐晶体，推测草酸作为胞外聚合物可有效固定重金属。黑色素是酚类化合物氧化产物，可存在于真菌细胞壁或胞外聚合物中，受到胁迫分泌量增加^[47]。黑色素中含大量的氨基、羧基、羟基等官能团，为重金属吸附提供结合位点^[48-49]。据报道，菌根菌彩色豆马勃（Pisolithusarrhizus）在含Cd、Cu和Fe的溶液中生长时，重金属大部分集中于黑色素层中^[50]，表明了黑色素对重金属有明显的吸附作用。

土壤中的重金属离子可以在细胞内外电位差的推动下被动进入质膜^[51]，也可以通过主动运输进入细胞^[52]。Zhu等^[53]对中国云南省14种不同的野生食用菌进行取样发现调查，Cu、Zn、Fe、Mn、Cd、Cr、Ni和Pb几种元素的含量范围分别为6.8~31.9、42.9~94.3、67.5~843、13.5~113、0.06~0.58、10.7~42.7、0.76~5.1 mg·kg^-1和0.67~12.9 mg·kg^-1，这说明某些大型真菌可以通过主动运输吸收更多重金属。Soylak等^[54]、Tuzen等^[55]对土耳其野生食用菌的研究结果也都暗示了食用菌对重金属的主动吸收。Bolchi等^[56]通过对黑孢块菌（Tuber melanosporum）转录组分析，获得了一系列与特定重金属转运相关的蛋白及一些ABC转运蛋白，同时在酵母细胞中验证了金属硫蛋白（MT）可以螯合Cd和Cu并降低其对真菌细胞的毒性。

金属硫蛋白（MT）普遍存在于真菌细胞内，由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸以不同的比例组合而成^[57]。该蛋白可与进入细胞内的重金属以螯合物形式存在，从而降低金属离子的活性，减轻对食用菌的毒害。在对蛇根木（Rauvolfia serpentina）的研究结果显示，Ni、Cu、Zn、Ag、Sn、Sb、Te、W、Au、Hg、Pb和Bi的硫酸盐、硝酸盐离子或砷酸盐、硒酸盐会诱导细胞合成MT，而Na、Mg、Al、Ca、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cs的无机盐、钼酸盐没有此种诱导效应。虽然多种金属离子可诱导产生MT，但是MT与Cd的螯合物最普遍，还有少量的Cu、Zn、Hg的螯合物^[58-59]。MT的合成受植物螯合态合成酶（TmelPCS）催化，当MT足够多螯合细胞内Cd时，酶的催化效应终止^[60]。MT对重金属的结合具有特异性，不同重金属元素及同种重金属不同存在形式都会有特定的MT与其结合^[59]，通常一个生物体内会存在多种MT基因，不同的重金属会诱导不同基因表达从而产生不同的MT蛋白^[61]。在松果鹅膏菌（Amanita strobiliformis）中，Ag和Cu可诱导AsMT1s蛋白产生，而Zn可诱导AsMT3产生^[61]；在双色蜡蘑（Laccaria bicolor）中有2种差异表达的MT基因，Cu和Cd可诱导LbMT1上调表达，Cu可明显提高LbMT2的表达量^[62]。

另外，在重金属胁迫下，由于某些酶活被抑制产生大量活性氧自由基（ROS），食用菌会通过分泌抗氧化酶（SOD、CAT、POD）和抗氧化剂（还原型谷胱甘肽，GSH）来抵御活性氧毒害^[63]。Zhang等^[64]对长根菇（O. radicata）子实体Pb的耐受分析结果显示，菌盖和菌柄的GSH在Pb处理浓度范围内随浓度上升分泌量先上升后下降；SOD随浓度上升分泌量上升；子实体在短时间胁迫时，CAT随处理浓度上升分泌量增加，胁迫时间增长时，CAT分泌呈先上升后下降的趋势；POD表现出与SOD相似的趋势。除此之外，泛素蛋白酶系统（ubiquitin-proteasome system）可能在重金属解毒中存在重要作用，研究表明，酵母细胞^[65-67]在Cd胁迫下，该系统会快速结合在错误折叠的蛋白上并将其降解，从而增加对Cd胁迫的耐受性。Chuang等^[24]通过对灵芝（G. lucidum）Cd胁迫下转录组的结果分析获得了10条与双孢蘑菇（A.bisporus）、香菇（L. edodes）、灰树花（Griflola frondosa）基因高度同源的差异表达片段，分别涉及细胞壁多糖合成[Exo-b-1，3-glucanase（exGS）、Glycosyltransferase（GTs）]、脂肪酸代谢[Phosphatidylserine synthase（PSS）]、氧化应激[Trehalose synthase（treS）、DyP-type peroxidase]、胞内物质运输[Vesicle trafficking sec1-like protein（Sec1-like）、predicted V-type ATPase]、硫化物代谢[Metallothionein（MT）]、DNA损伤[Alkylated DNA repair protein（AlkB）]、真菌发育[Hydrophobin 2（Hyd2）]等生化过程，但此研究未曾涉及后续验证，没有确切的证据证明其相关性，更无法明确各基因的调控途径及调控方式。对墨汁鬼伞（Coprinus atramentarius）Cd抗性^[68]及Pb抗性^[69]研究中均发现14-3-3蛋白表达量上调，并受Cd和Pb诱导产生，并且先前研究表明此蛋白在番茄中受Fe诱导、在藻类中受Cu^[70]诱导，众多研究发现14-3-3蛋白在金属转运过程中可与V-ATPase的A亚基^[71]及膜上的H⁺-ATPase^[72]相互作用，但此蛋白的功能仍然未知。

上述研究虽然已经揭示了不少与大型真菌重金属抗性有关的机制，但关于大型真菌累积重金属的生理生态学机制有待深入研究。

大型真菌对重金属的富集具有时期和部位的选择性，这与不同功能部位不同时期调控机制密切相关。为了将大型真菌更好地应用在土壤修复中，对其不同生长时期、生长部位的富集分子机理的研究必不可少。

大型真菌作为环境污染的指示剂已有一些报道，如利用地衣类真菌监测大气中硫、氟、氯等有害成分及重金属离子浓度^[73]；利用毛头鬼伞（Coprinus comatus）、鸡腿菇（C. comatus）监测环境中铅的污染^[38]；利用灵芝（G. lucidum）作为生物指示剂检测空气中的铯污染^[74]；这种生物指示剂不仅精准度高，而且花费极低。但是关于大型真菌被利用在土壤重金属检测方面的报道很少，作为一项经济实用的检测手段有待进一步研究和开发。

土壤中重金属污染是环境治理的重点也是难点。一些大型真菌已经被用于与一些经济作物试种，如稻田套种木耳（A. auricula）^[75]、双孢蘑菇（A. bisporus）^[76]、玉米地套种平菇（Pleurotus spp.）^[77]、草菇（Volvariella volvacea）^[78]等菌-粮-菜套作模式来降低农作物对重金属的富集。大型真菌也可以改变土壤重金属存在形式，来降低植物对重金属吸收^[79]。食用菌栽培废料是很好的吸附材料，可以吸附土壤重金属来改善土壤条件^[80]。这些近年发展的食用菌修复方法丰富了土壤重金属治理的手段，正在逐渐展现出相对传统化学手段甚至超累积植物的优势。

长满菌丝的基质材料可以制成各种过滤器，对各种污染水体进行拦截处理；微生物菌体本身或代谢物，可以对水体中污染物进行絮凝固定^[81-82]。目前利用大型真菌净化水体应用最多的是净化石油污染，现已发展到产业化生产阶段，在净化水体重金属污染方面报道较少。García-Delgdo等^{[80, 83]}研究结果表明，在农业灌溉中，双孢蘑菇（A. bisporus）培养废料能有效吸收污染水中Cd和Pb。

加强育种工作，对一些富集能力强的野生菌加快人工驯化的步伐，这是将菌种应用于重金属富集研究的前提。对于已经驯化成功的大型真菌，扩大重金属耐受及富集筛选的范围，挖掘更多、富集能力更强的菌种应用于重金属土壤或水的治理；同时选育重金属低富集甚至不富集的菌种或通过改良降低食用菌的重金属富集，一方面可将污染土地加以利用，同时可以生产出安全优质的食用菌产品。在选育食用菌低富集重金属方面已取得了一定成效，江枝和等^[84]通过不同硒镧配施培养基，在显著增加姬松茸（A. blazei）产量的同时显著或极显著降低了姬松茸（A. blazei）对Pb、Cd、Hg、As的富集量；翁伯琦等、刘朋虎等^[85-87]以姬松茸（A. blazei）菌株J1为材料，用⁶⁰Co进行辐射，选育出镉、汞、铅、砷低富集的新菌株J3、福姬5号、福姬77；杨小红等^[88]通过不同平菇品种对4种重金属的吸收富集的研究，筛选出重金属低富集品种P-8；Zhu等^[53]通过对云南省14种野生食用菌重金属含量测定，确定出对Cu、Cd、Pb低吸收量的品种分别为杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、杏鲍菇（P. eryngii）和香菇（L. edodes），富集量均远低于WHO规定的重金属安全限；雷敬敷等^[20]研究发现凤尾菇（P. pulmonarius）、香菇（L. edodes）的子实体对Pb富集量很低，加强低富集重金属食用菌品种的选育是今后研究的一个重要方向。

同时由于食用菌子实体形成条件比较苛刻，标本采集具有很强的时间限制，比如灵芝（G. lucidum）属高温型菌种，北方地区一般集中在夏季栽培，为了实现周年栽培，我们之前的研究已成功实现了北方地区冬季地栽灵芝的成功出菇^[89]，因此培育适应性强的品种或者设计合理的、不受时间季节限制、易于广泛使用的栽培方式是今后研究的一个重要方向。

土壤重金属修复是一个关系国计民生的大事，通过基因工程手段对某些大型真菌进行改良，获得重金属高富集或低吸收的“超级菌”是一个非常有前景的研究方向。“超级菌”的建立是以重金属富集机制为基础的，目前富集机理虽有部分研究，但是仍然很不完善，一些与富集相关的基因或蛋白虽已报道，但调控方式仍然未知，因此关于机理更深层次的研究是必不可少的。

大型真菌作为一种新型的修复材料，修复效率高，易回收，但是回收后超标菇体的处理问题越来越受到更多人的关注。由于某些大型真菌如食药用菌含有多种成分（如多糖、甾醇、维生素）对人体具有养生保健功能，对于回收的菇体，可以预先检测某些成分的重金属含量，对于没有重金属超标成分可以先对该种有效成分进行提取，加以利用，对于剩余成分烘干或晾干后焚烧，收集灰分交于其他部门对其中重金属进行回收。

大型真菌作为一种新型重金属污染土壤修复材料研究刚刚起步，高的富集能力证明了其高的修复潜力。众多研究表明大型真菌在土壤重金属修复方面有很好的应用价值，虽然存在一定的问题，但会随科研的深入逐步解决。