随着经济快速发展人类对自然环境的开发和利用程度急剧加大，采矿、冶炼等工业“三废”的不合理排放以及污灌农田等行为，使得含Pb的污染物进入土壤环境中，造成严重的土壤污染^[1-2]。Pb作为一种不可降解的有毒污染物，不仅影响土壤理化性质，还会降低农作物产量和质量^[3]，过量的Pb通过食物链进入人体，危害人类健康，尤其是对人类神经、造血系统的毒性危害严重，调查发现人类血铅含量主要来源于土壤^[4]。因此如何修复污染土壤成为土壤学和环境科学领域的重要研究内容。

植物修复技术作为一种新兴、高效的土壤修复技术得到广泛认同和应用。有关超富集植物的提出以及耐重金属植物的研究逐渐增多^[5-6]。目前发现Pb超富集植物具有植株矮小、生长速度慢、生物量小及生态适应性窄等缺点^[7]。对于植物吸收重金属后的生理生态响应及植物的抗性机制研究，多集中在农作物、经济作物等草本植物或水生植物^[8]，对于具有高生物量，吸收并积累重金属能力强、生长周期长的木本植物的研究较少。

紫穗槐（Amorpha fruticosa）作为豆科紫穗槐属植物，具有较强的耐寒、耐旱和抗贫瘠特性。由于其具有根系发达、生长快、易繁殖等特点，是北方常见的绿化及造林灌木。常见于农田排水沟渠边，铁路路堤边坡以及河岸等地，是防风固沙、水土保持、土壤改良的重要植物^[9-11]。关于紫穗槐对于重金属富集方面的研究已经有一些报道^[12-13]，然而对于紫穗槐在重金属胁迫下的生理生化特征响应方面的研究较少。本研究主要侧重阐明在Pb污染环境胁迫下，紫穗槐叶片丙二醛（MDA）含量、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、光合作用参数以及叶绿素荧光参数等生理指标的响应规律，为阐明紫穗槐对重金属的耐受能力，利用紫穗槐进行土壤重金属污染的生态修复提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 实验材料

选用1年生紫穗槐幼苗进行盆栽试验。选取长势一致的紫穗槐幼苗在2015年4月10日移植于装有2.5 kg河沙的塑料盆（盆底无孔，直径18 cm，高16 cm）中，每盆1株。建筑用河沙在使用前用自来水冲洗，直至清洗后的水清澈，以去除河沙中杂质干扰。由于盆中含有部分水分，每隔10 d浇1次2倍的Hoagland营养液400 mL，以保证盆中Hoagland营养液约为1倍，每日补充适量水分，自然光照条件下生长。于2015年5月20日进行Pb胁迫处理。浓度设定根据预实验以及实际土壤Pb污染情况设定^[14]，试剂选用Pb（NO₃）₂，胁迫浓度分别为0、100、300、600 mg·kg^-1。各实验组设3个重复，处理30 d后测定各项指标。

1.2 测定方法 1.2.1 光合作用参数的测定

在晴朗天气上午的9：30—11：30，采用Li-6400XT便携式光合作用测量系统（Li-Cor Inc.，USA）测定净光合速率（Pn，net photosynthetic rate，μmol CO₂·m^-2·s^-1），气孔导度（Gs，stomatal conductance，mmol H₂O·m^-2·s^-1），胞间CO₂浓度（Ci，intercellular CO₂ concentration，μmol CO₂·mol^-1），测定时选择红蓝光源，光照强度为1 000 μmol·m^-2·s^-1，CO₂气体由小钢瓶提供，控制浓度为400 μmol·mol^-1。每株选取顶端向阳第5~8片叶，每处理重复5次，取平均值。

1.2.2 叶绿素荧光参数的测定

选在晴天上午9：30—11：30，利用超便携式调制叶绿素荧光仪MINI-PAM-II（WALZ，Effeltrich，Germany），在上述测定CO₂气体交换参数叶片相近位置进行测定，叶片暗适应30 min后，测定光系统Ⅱ（PSII）最大量子产额F_v/F_m =（F_m-F_o）/F_m。利用内置自动光源测定荧光诱导曲线，计算PSII实际量子产量Ф_PSII =（F_m′-F_t）/F_m′，光系统Ⅱ开放反应中心转化效率F_v′/F_m′=（F_m′-F_o′）/F_m′，光化学淬灭q_P =（F_m′-F_t）/（F_m′-F_o′），非光化学淬灭NPQ =（F_m-F_m′）/F_m′。式中F_m′和F_t分别为光适应过程中的饱和荧光值和实时荧光值，F_o′为光适应过程中最小荧光值，F_m和F_o分别为暗适应后最大荧光值和最小荧光值^[15]。

1.2.3 电解质外渗率、丙二醛（MDA）及抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性的测定

取紫穗槐新鲜叶片，在去离子水中冲洗干净，用滤纸拭干，测定电解质外渗率和丙二醛（MDA）含量。电解质外渗率采用电导仪法^[16]，MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）氧化法^[16]。

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑光化还原法测定，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定，过氧化氢酶（CAT）活性采用240 nm光密度比色法测定，具体测定方法参照文献[17]。

1.2.4 相对叶绿素含量测定

采用SPAD-502叶绿素测定仪（日本Konica公司产品），在测定光合作用的相同位置测定叶绿素相对含量。相同处理10次重复取平均值。

1.3 数据分析

用Microsoft Excel 2010和SPASS 13.0进行数据处理和统计分析。采用单因素方差分析，Duncan检验比较样本间参数差异显著性，差异显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析 2.1 Pb胁迫对紫穗槐光合作用参数的影响

光合作用是植物生长发育的基础，为植物的生命活动提供能量和物质，净光合速率（Pn）是表示光合作用的重要指标。结果显示100 mg·kg^-1 Pb处理下幼苗Pn（图 1-A）显著高于其他处理组，300 mg·kg^-1和600 mg·kg^-1 Pb处理下幼苗Pn显著低于对照组。气孔导度（Gs）（图 1-B）和胞间CO₂浓度（Ci）（图 1-C）在100 mg·kg^-1 Pb处理下均显著高于其他处理组。气孔限制值（Ls）（图 1-D）在300 mg·kg^-1 Pb处理下显著高于100 mg·kg^-1和600 mg·kg^-1处理组，与对照组无显著差异。

2.2 Pb胁迫对紫穗槐叶绿素荧光参数的影响 2.2.1 最大光化学效率

由图 2可以看出，对照和100 mg·kg^-1 Pb处理下紫穗槐的F_o、F_m和F_v /F_m没有差异性，说明此处理浓度并没有改变反应中心的原初光化学活性。300 mg·kg^-1和600 mg·kg^-1处理条件下紫穗槐的F_o（图 2-A）和F_v /F_m（图 2-B）与对照和100 mg·kg^-1浓度处理组有显著差异。F_m在100 mg·kg^-1处理组中虽较其他处理组低，但并没有显著差异性（图 2-C）。

2.2.2 荧光猝灭动力学

如图 3所示，当Pb胁迫浓度≥300 mg·kg^-1时，紫穗槐叶片实际光化学效率（Ф_PSII（图 3-A）、光化学猝灭系数（q_P）（图 3-B）、光系统Ⅱ开放反应中心转化效率（F_v′/F_m′）（图 3-C）显著低于对照，非光化学猝灭系数（NPQ）（图 3-D）升高，说明Pb胁迫改变了紫穗槐叶片激发能的分配。

2.3 Pb胁迫对紫穗槐生理生化特性的影响 2.3.1 紫穗槐叶片MDA含量和膜透性

随着Pb浓度的升高，MDA含量呈上升趋势（图 4-A），在300 mg·kg^-1与600 mg·kg^-1处理条件下，MDA含量显著高于对照组。电解质外渗率随着Pb胁迫强度增加，均显著高于对照组，600 mg·kg^-1处理条件下达到最大，显著高于对照及其他处理组，较低浓度Pb（100 mg·kg^-1和300 mg·kg^-1）处理下其电解质外渗率之间无显著差异（图 4-B）。

2.3.2 紫穗槐抗氧化酶活性和叶片SPAD值

SOD活性随Pb处理浓度的增加，均显著高于对照，在100 mg·kg^-1浓度处理下活性最大，但随后下降，到达600 mg·kg^-1时又有所升高（图 5-A），表明紫穗槐对Pb有一定的耐受性。POD活性随Pb胁迫增加呈上升趋势，活性均显著高于对照，600 mg·kg^-1处理下POD活性显著高于低浓度处理组（图 5-B）。CAT活性随Pb处理浓度增加先升后降，在300 mg·kg^-1处理下达到最大，显著高于其他处理组（图 5-C）。紫穗槐叶片在100 mg·kg^-1处理下SPAD值显著高于对照及其他处理组，600 mg·kg^-1处理组SPAD值与对照组无显著差异（图 5-D）。

3 讨论 3.1 紫穗槐SPAD值和光合作用参数对Pb胁迫的响应

光合作用是植物生长的生理基础，重金属胁迫能够抑制植物的光合作用，从而影响植物的正常发育^[18]。SPAD值与叶片叶绿素含量呈正相关关系，可以反映植物叶片叶绿素含量变化^[19]。重金属Pb污染对于本研究中紫穗槐在600 mg·kg^-1浓度处理下，SPAD值与对照无显著差异，表明Pb浓度即使在600 mg·kg^-1浓度时，仍不足以破坏紫穗槐叶绿素的生物合成，这与李永杰^[20]的研究结果不同，原因可能是因为试验中栽培介质以及处理试剂等条件不同导致有效态Pb的含量不同，从而对紫穗槐叶绿素的损害程度不同^[21]。

导致植物叶片Pn的降低有两种因素：气孔限制和非气孔限制。只有当Ci和Gs以相同的方向变化时，才能确定光合的下降是气孔限制造成的；当Ci升高而Gs下降时，主要因素是非气孔限制^[22]。本研究结果显示在300 mg·kg^-1处理浓度下，Ls升高且显著高于100 mg·kg^-1处理组，Gs下降，Ci降低，说明此浓度处理下，Pn的降低主要受气孔限制因素导致。Ls在600 mg·kg^-1浓度处理下显著低于300 mg·kg^-1处理组，但Ci增高，表明此时引起Pn降低的因素主要是非气孔限制，即随着Pb浓度的增加，抑制了紫穗槐叶肉细胞的光合活性导致细胞间CO₂积累。这一结果与李亚藏等^[23]研究Pb对山荆子（Malus baccata）光合作用的影响结果类似。

3.2 紫穗槐叶绿素荧光参数对Pb胁迫的响应

叶绿素荧光特性常用于检测光合机构对环境胁迫的响应^[24]。本研究结果显示紫穗槐在≥300 mg·kg^-1 Pb处理条件下，F_v /F_m显著降低，同时F_o显著升高，而F_m在各处理组中没有显著性差异变化。诸多研究表明F_v /F_m的值会随着胁迫程度的加重而降低，原因是PSⅡ反应中心发生不可逆转的破坏或失活^[25]，但也有研究发现F_v /F_m降低是植物保护反应的结果^[26]。Guo等^[27]认为在胁迫条件下PSⅡ反应中心受到损伤会导致F_o升高，但反之不成立。F_m降低可能预示着PSⅡ叶绿素结构受到破坏或者电子传递受到抑制^[28]。综上表明紫穗槐在≥ 300 mg·kg^-1 Pb胁迫下，光系统Ⅱ反应中心活性可能受到一定程度的损伤，原初光能转化效率降低，但并未造成不可逆转的破坏。

Ф_PSⅡ和q_P都反映植物在光适应状态下进行光化学反应的能力^[18]，植物通过启动NPQ途径耗散过剩的激发能以保护光合机构免受伤害，所以在受到重金属胁迫时NPQ的值会增加^[29]。本研究结果显示当Pb浓度≥300 mg·kg^-1时，Ф_PSⅡ、q_P和F_v′/F_m′值较对照显著下降，而NPQ值增加，说明Pb可以抑制PSⅡ光合电子传递能力，降低电子传递速率，紫穗槐通过非辐射能量途径耗散过剩光能，保护自身光合机构。

3.3 紫穗槐叶片生理生化特性对Pb胁迫的响应 3.3.1 紫穗槐叶片MDA和膜透性对Pb胁迫的响应

MDA是膜脂过氧化产物之一，其含量变化常作为检测逆境条件下膜系统受损程度的指标^[30]。紫穗槐在100 mg·kg^-1 Pb胁迫处理下，MDA含量与对照组无显著差异，可能与SOD活性增加使得氧自由基含量减少，从而弱化脂质过氧化作用有关^[31]。当300 mg·kg^-1 Pb胁迫时，MDA含量和电解质外渗率均呈现上升趋势且显著高于对照组，说明随着Pb胁迫程度的增加，紫穗槐叶肉细胞活性氧水平和膜脂过氧化程度加深，膜的功能和结构遭到破坏。

3.3.2 紫穗槐叶片抗氧化酶活性对Pb胁迫的响应

植物体通过SOD、POD和CAT等抗氧化酶相互协调，清除过多活性氧以维持机体活性氧代谢动态平衡，保护或缓解细胞结构的破坏^[32]。紫穗槐叶片中SOD、POD活性在不同Pb胁迫处理下，酶活性显著高于对照，因为在重金属胁迫下，植物体内具有的活性氧清除系统和具有抗性特征的生理活动被诱导，从而导致植物体内SOD和POD的合成增强^[33-34]。CAT活性变化趋势则随着Pb胁迫浓度的增加表现为先升高后降低，表明一定浓度的Pb处理能够诱导紫穗槐叶片CAT活性升高，当Pb胁迫达到600 mg·kg^-1时，紫穗槐叶肉细胞内的酶系统受到损害，代谢趋于紊乱，抑制抗氧化酶基因的表达，导致CAT活性下降，这与郭艳杰等^[35]的研究结果类似。

4 结论

低浓度Pb胁迫处理（100 mg·kg^-1）显著提高了紫穗槐的光合作用；中低浓度Pb胁迫处理（≤300 mg·kg^-1）可以增强紫穗槐抗氧化酶活性，提高叶绿素含量；随着Pb胁迫浓度的增加叶片中抗氧化酶SOD、POD活性显著高于对照组；当Pb胁迫浓度达到600 mg·kg^-1时，CAT活性开始有所下降，降低光合作用的主要因素是非气孔限制，碳同化能力下降，但并未对紫穗槐叶绿素荧光特性造成严重损伤，说明紫穗槐对Pb有较好的耐受性。

为了更好地探讨紫穗槐对Pb污染土壤的植物修复能力，今后还需要在组织器官水平上研究紫穗槐对Pb的吸收转运积累情况。