木霉菌作为一种资源丰富的微生物类群，分布广泛、环境适应性强，在促进植物生长及病害防治方面具有十分重要的作用，报道较多的为哈茨木霉、绿色木霉、康氏木霉、长枝木霉等几个种^[1-3]。有研究表明，木霉菌拌种或土施可促进植物生长，对辣椒、玉米、马铃薯、花生、黄瓜等多种作物有促生效应^[3-4]。近年来，木霉菌在促生、抗病方面的研究取得了大量成果，Chacbin 等^[4]发现，木霉菌对土传病害的生防作用与植物的根系密切相关，菌株通过定殖于根系外表皮，调节植物新陈代谢，从而促进根系发育、提高作物产量以及植株抗性，部分木霉菌的作用机制与丛枝菌根真菌类似^[5]。Jeerapong等^[6]研究表明，木霉菌M031 能够分泌一种新的萘烷衍生物，能够在低浓度下抑制炭疽病菌的生长、减少病害的发生。木霉菌菌株在土壤中还能提高土壤肥力和酶活，陆利民等^[7]发现施用木霉菌剂能够增加土壤中微生物总量，同时提高了土壤的脲酶、中性磷酸酶、蔗糖酶、纤维素酶、过氧化氢酶活性，从而促进青菜根系生长和产量的提高。木霉菌中的哈茨木霉菌具有较强的定殖能力，能够在植物根际快速生长繁殖，优先占领植物体表面位点，阻止病原真菌侵入，还能通过分泌促生物质促进作物生根，提高作物抗逆性，对幼苗成活率提高和植株健壮都具有显著效果^[4]。赵忠娟等^[8]研究发现，哈茨木霉LTR-2能够促进盐胁迫下蔬菜种子的萌发以及幼苗的生长和光合作用，增强幼苗对盐胁迫的耐受性。有研究表明，哈茨木霉的代谢产物对种子的萌发及植株的生长有不同程度的促进作用，穆红梅等^[9]利用不同浓度的哈茨木霉提取液处理大豆、黄瓜、生菜种子，结果表明在40~80 mg·L^-1 的提取液浓度下，3 种作物种子的发芽指数、根长及活力指数都有显著提高。

随着微生物肥料行业的发展壮大，大量的优良菌种资源应用到微生物肥料产品中，木霉菌作为一类植物促生、生防菌种，可有效地促进作物生长、减轻作物病害，同时具备使用安全、环境友好等特点，在国内外已被开发成制剂应用于生物肥料、生物农药领域，如美国的Topshield（哈茨木霉T22）和以色列的Trichodex（哈茨木霉T39）^[2]，但国内多未应用于实际生产，而且存在发酵产孢低、稳定性差、货架期短的问题。为此，本研究以本实验室保藏的一株筛分自健康土壤的木霉菌M2为供试菌株，研究了M2 孢子拌土对盆栽小白菜产量的影响，并对菌株进行了分析鉴定，以期为微生物肥料的研发提供优良菌种与实践依据。

木霉菌M2 保藏于养分资源高效开发与综合利用国家重点实验室菌种保藏室，于2015 年5 月采用稀释涂布平板法筛分自山东省寿光市健康、高产大棚辣椒根际土壤。

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1 000 mL，自然pH；种子培养基：麸皮20.0 g，葡萄糖10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 自然，121 ℃灭菌20 min。固体发酵培养基：秸秆粉30%、玉米粉30%、麸皮40%，按液固比1.5:1 加入含0.5% KH₂PO₄、0.25% MgSO₄ 的盐溶液，搅拌均匀，121 ℃灭菌20min。

挑取一环斜面上的木霉菌M2 孢子接入到PDA培养基平板上，置于31 ℃恒温培养箱培养5 d，观察菌落和孢子的形态特征。

将斜面上的M2 孢子接入种子培养基中，种子培养基装瓶量为60 mL·250 mL^-1，置于31 ℃恒温震荡培养箱中，200 r·min^-1条件下连续培养24 h后，离心收集菌丝，并用灭菌滤纸吸干多余水分，然后转移至预冷的研钵中，加入液氮并迅速研磨，利用真菌基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工），参考文献^[10]的方法提取木霉菌M2 基因组并进行ITS序列扩增。1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR 产物回收及测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

将测得的M2 菌株的ITS序列交GenBank，使用BLAST 程序将测定序列与NCBI 数据库中相关菌株的ITS 序列进行比对，然后使用MEGA4.0软件构建系统发育树。

挑取M2 孢子接入种子培养基中，种子培养基装瓶量为60mL·250mL^-1，置于31℃恒温震荡培养箱中，200 r·min^-1条件下震荡培养20~24 h后，按10%接种量将M2 种子液接入装有固态发酵培养基的三角瓶中，固态发酵培养基装瓶量为10 g·250 mL^-1，32 ℃静置培养4 d^[11]。将扩繁后的M2 固体发酵物于50 ℃烘干至水分10%左右，粉碎后即得木霉M2 孢子粉。

试验于2016 年2 月7 日—3 月19 日在金正大生态工程集团股份有限公司的智能玻璃温室中进行。

供试小白菜（Brassica chinensis L.），品种为热抗605，本地种子站购得，为本地常用品种；供试底肥为金正大生态工程集团股份有限公司生产的沃夫特硝基复合肥（15-6-20），木霉菌剂为M2 菌株固体发酵后干燥、粉碎制得，孢子含量为5.0×10⁹ cfu·g^-1；供试土壤为棕壤，基本农化性状见表 1。

表 1　盆栽用土壤基本理化性状 Table 1　The basic property of experimental soil

表选项

实验采用盆栽方式进行，土壤过筛后，每盆装土2 kg，加入称量好的底肥、菌剂，混匀后装入直径为23cm、高13 cm 的塑料盆中待用。试验设4 个处理（表 2），以沃夫特硝基复合肥（15-6-20）作为基肥，空白组为不施用菌剂对照（CK），处理组为添加不同菌量的菌剂，基肥与菌剂均按照盆栽为大田的两倍进行，每个处理设4个重复。各处理复合肥、菌剂全部作为基肥一次性施入土壤，其中处理1 添加木霉孢子5.0×10⁷ cfu（T1，0.005 g·kg^-1 土壤），处理2 添加木霉孢子5.0×10⁸ cfu（T2，0.05 g·kg^-1土壤），处理3 添加木霉孢子5.0×10⁹ cfu（T3，0.5 g·kg^-1土壤）。每盆播种10株以上的小白菜种子，期间根据土壤缺水情况适时定量浇水，管理措施一致。2016 年2 月20 日小白菜长出2片针叶进行间苗定植，每盆2株，于3 月19 日收获时测定鲜重、叶绿素和叶片数，烘干后称干重。

表 2　盆栽试验处理 Table 2　The pot treatments

表选项

土壤的有机质含量、NPK 含量、pH 值等基本理化性质按常规方法分析^[11]。其中土壤有机质含量用重铬酸钾容量法-外加热法；pH 值采用5.0:1.0 水土比，电极测定法；全氮含量用半微量开氏法；碱解氮采用扩散法吸收测定；速效磷含量用碳酸氢钠浸提；速效钾含量采用火焰光度计法。

叶片数、鲜重、干重只选择绿色可食用部分；SPAD 值测定采用SPAD-502Plus 型叶绿素仪进行；干重、鲜重测定按常规方法进行^[12]。

试验数据采用EXCEL 进行处理，利用SPSS 16.0软件进行数据统计及差异显著性分析。

M2 菌落在PDA培养基上生长良好，菌落致密，浅绿色，不透明；通过光学显微镜观察菌丝和孢子形态，菌丝细长，无分隔，菌丝出现分支，孢子多为圆形或椭圆形（图 1）。

图 1　菌株M2 在PDA培养基上的菌落（左）及孢子（右）形态 Figure 1　The characteristics of strain M2 in PDA medium（left）and spores（right）

图选项

木霉M2 的ITS 基因序列扩增后片段长度为565bp，PCR 扩增片段电泳结果如图 2 所示。将扩增序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上进行比对，由比对结果可以看出木霉菌M2 与哈茨木霉Trichoderma harzianum strain I20、Trichodermaharzianum strain CEN779、Trichoderma harzianum strainCEN261 的序列相似度均能达到99%，结合菌株形态及显微镜观察，确定M2 为哈茨木霉，其系统发育树见图 3。

右为Marker，左为M2 ITS 扩增片段 图 2　菌株M2 ITS 序列PCR扩增结果 Figure 2　The ITS sequence of PCR amplification results of M2

图选项

图 3　木霉菌M2进化树 Figure 3　The evolutionary tree of Trichoderma M2

图选项

与CK 相比，T1 小白菜叶片叶绿素含量降低0.65%，T2 叶绿素含量提高2.75%，T3 叶绿素含量提高4.76%（图 4），T2 与T3 处理均提高了小白菜叶片中叶绿素含量，差异均不显著，T1 与CK 相比叶绿素无明显差异。叶片数与CK 对比，T1 与CK 相同，T2与T3 处理均提高了小白菜叶片数，其中T2 较CK 叶片数增加11.76%，T3 较CK 叶片数增加13.29%，差异达到显著水平，说明在施加复合肥为底肥的情况下施用哈茨木霉M2 孢子粉对叶绿素、叶片数都具有提高作用，能够显著增加可食用叶片数。

不同小写字母表示同一指标数据P＜0.05水平差异显著 图 4　哈茨木霉M2 对小白菜叶片数、叶绿素含量的影响 Figure 4　The effect of TrichodermaM2 on chlorophyll content and leaf number of Brassica chinensis

图选项

由表 3 可知，与空白处理（CK）相比，T1、T2、T3处理均提高了单株小白菜的鲜重和干重，添加M2 菌剂的每个处理单株鲜重增加0.46~11.53 g，单株干重增加0.01~0.61 g，其中T1 较对照（CK）单株鲜重提高1.22%，单株干重提高0.16%，T2 较CK 单株鲜重提高18.33%，单株干重提高12.46%，其中T3 增产最高，较CK 单株鲜重提高30.26%，单株干重提高20.08%。说明在施加底肥的基础上施用哈茨木霉M2 孢子拌土，能够显著提高小白菜的鲜重和干重，在每盆5.0×10⁷~5.0×10⁹ cfu 的范围内用菌量越多促生效果越好。

表 3　不同处理对小白菜单株鲜重、干重的影响 Table 3　Effect of different treatments on fresh weight and dry weight of Brassica chinensis L.

表选项

大量的研究证实了木霉菌对植物种子、幼苗及根系的生长发育均有促进作用。一般认为，木霉菌促进作物生长的作用机理主要有：（1）在生长繁殖过程中产生植物生长调节类物质，例如绿木霉（Tricho-dermavirens）、哈茨木霉（T. harzianum）等菌株能够代谢产生吲哚乙酸（IAA）、类植物生长素，对作物生长具有促进作用^[13-14]；（2）木霉菌及其分泌的代谢产物能够减轻根际有害物质的侵害，有研究表明，有的木霉菌可以产生氰化物降解酶^[13]，有的木霉菌还能减轻土壤重金属对植物生长的抑制作用^[15]；（3）木霉菌可以提高植物对某些微量元素的摄取率^[16-17]。王恢^[18]使用不同浓度哈茨木霉菌的泥浆作为葡萄硬枝扦插的蘸根剂，实验结果表明，哈茨木霉菌作为蘸根剂可显著提高葡萄苗的成活率，增加扦插苗的生根数量。杨春林等^[19]研究发现，木霉菌对黄瓜、番茄、芹菜、白菜、菠菜和辣椒等蔬菜的生长有较强的促生作用。胡琼^[20]对哈茨木霉TC 在辣椒上的促生效果进行研究，使用TC菌株拌土或拌种能够增强辣椒种子的活力，提高发芽率，降低倒伏率，促进后期株高和叶片面积的提升，使植株开花、挂果提前。

不同木霉菌株对作物的促生、抗病效果有不同的表现，一方面与菌种自身特性有关，另一方面受实验作物及土壤、环境影响较大。本研究中，通过设置木霉菌M2 不同的孢子添加量拌土用以对比不同用量对小白菜的促生作用，盆栽试验结果表明，不同添加量的哈茨木霉M2 孢子粉拌土对小白菜的生物量的增加均起到了促进作用，提高了小白菜根系对水分的吸收、干物质的积累以及叶片叶绿素含量，而且添加孢子量越高增产效果越明显，呈正相关，这说明哈茨木霉M2 在此培养条件下菌种对小白菜的生长起到明显的促进作用。杨兴堂等^[21]研究表明，棘孢木霉能够通过提高黄花蒿叶的光合作用、促进土壤养分溶解等途径促进植株生长健壮，从而提高黄花蒿产量及植株抗病能力。结合本研究结果，M2 对小白菜产量及叶绿素含量的提高可能与哈茨木霉促进了小白菜根系的生长及光合作用有关。兼顾哈茨木霉M2的施用成本为5 000 元·t^-1，孢子粉的用量每盆在5.0×10⁸ cfu 左右性价比最高，折合每公顷用量56.25 kg。同时，在叶绿素、叶片数上施加M2 孢子粉处理较CK 也有明显提高，但叶绿素含量差异不明显。SPAD 值也称作绿色度，是反映植物相对叶绿素含量的指标。叶绿素是植物光合作用的重要场所，也是反映植物抗逆生理特性的指标之一。陆宁海等^[22]研究表明，在使用哈茨木霉制剂后番茄苗叶绿素含量明显提高，这与本试验结果存在一定差异。可能与不同的供试作物和菌种有关，不同促生菌在作物的促生作用效果方面存在一定差别。

通过分子生物学鉴定结合形态观察的方法确定M2 菌株为哈茨木霉。在小白菜盆栽试验中，每盆分别添加M2 孢子5.0×10⁷ cfu（T1）、5.0×10⁸ cfu（T2）、5.0×10⁹ cfu（T3）进行实验，结果表明，T1、T2、T3 对小白菜的生长均起到了促进作用，其中T2 较CK 鲜重提高18.33%，干重提高12.46%；T3 较CK 鲜重提高30.26%，干重提高20.08%，差异极显著，这说明哈茨木霉M2 对小白菜的生长起到明显的促进作用。在本实验中，T2、T3 对叶绿素、叶片数的提高也有一定作用，但叶绿素增加差异不明显。

目前，微生物菌剂作用的稳定性常常受到外界环境的影响，所以后续实验中，需在不同土壤环境和气候条件下进行多种作物的田间应用实验，对哈茨木霉M2 促生效果、生防效果进行研究和验证，为其开发成功能、效果稳定的农用微生物菌剂产品奠定基础。