我国土壤重金属Cd 污染形势严峻，环保部和国土部联合发布《全国土壤污染状况调查公报》指出，全国土壤重金属点位超标率达到16.1%，其中Cd点位超标率最高为7.0%，局部地区甚至更高。据统计，Cd 污染耕地面积达到1.4万hm²，涉及11 个省(市)的25个地区^[1]。由于Cd 在土壤中具有较强的移动性和生物有效性，极易被水稻根系吸收并在籽粒中累积^[2]。涂杰峰等^[3]调查福建省1 458 份稻米样品发现，5%稻米Cd 含量超过0.2 mg·kg^-1 的国家食品卫生限量标准(GB2762—2005)。雷鸣等^[4]研究发现，湖南各地稻米Cd含量范围为0.002~3.71mg·kg^-1，平均值为0.28mg·kg^-1，稻米Cd 超标率高达36%。农业部稻米及其制品质量监督检验测试中心对全国稻米质量安全普查结果表明，稻米Cd 超标较为严重，达到10.3%^[5]，使得我国每年约有5.0伊107 kg 稻米超标^[1]，对人体健康、社会稳定以及农业可持续发展均构成较大威胁，国务院颁发的《土壤污染防治行动计划》要求，在江西、湖北、湖南等重金属污染水稻主产区开展修复治理工作^[6]。

膨润土(Bentonite)是以蒙脱石(Montmorillonite)为主要矿物组成的黏土岩，化学结构式为(MgCa)O·Al₂O₃·5SiO₂·nH₂O。膨润土的结构单位为Si-O 四面体和Al-O₄(OH)₂ 八面体组成^[7-8]，具有较大的比表面积、阳离子交换能力和吸附性能，被广泛用于重金属污染水体修复实践。20世纪80 年代初就有利用膨润土作重金属离子吸附剂的研究报道。Lo 等^[9]利用0.1%膨润土修复10 mg·kg^-1的重金属溶液，Cu²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺去除率分别达到84.5%、80.8%和90.7%。在pH 值为5 时，膨润土对Pb、Zn 和Cd 的吸附量仍达到411.2、163.4 mg·g^-1和71.8 mg·g^-1。加入适量聚丙烯酰胺后，膨润土对Zn²⁺、Pb²⁺和Cd²⁺的去除率分别为83.1%、92.7%和85. 4%^[10]。前期研究发现，添加膨润土能有效缓解Cd 胁迫对作物幼苗的毒害作用，抗胁迫能力一定程度上有所提升^[11-12]，且对Cd 单一以及Cd-Pb复合污染土壤具有较好的修复效果^{[8, 13]}。本研究在此基础上，通过盆栽实验和小区试验，研究膨润土对Cd 污染水稻土的钝化修复效应，阐明其施用后对水稻生长、土壤Cd 形态含量、土壤酶活性以及对Cd 的吸收特征，以期实现Cd 污染土壤农田修复大面积示范和推广应用。

盆栽实验土壤来自天津市郊农田，土壤类型为潮土，其理化性质：pH 值为8.2，黏粒、粉粒和砂粒含量分别为29.0%、61.6%和9.4%，CEC(阳离子交换量)为14.7 cmol·kg^-1，有机质含量为20.0 g·kg^-1，全N 为1.3mg·kg^-1，有效P 为66.7 mg·kg^-1，速效K 为328.0 mg·kg^-1，Cd 含量为0.23 mg·kg^-1。大田小区试验位于湖南省湘阴县，土壤类型为红壤，其理化性质为pH值为6.2，黏粒、粉粒和砂粒含量分别为43.71%、40.83%和15.46%，CEC(阳离子交换量)为9.16 cmol·kg^-1，有机质含量为10.3 g·kg^-1，全N 为0.72 mg·kg^-1，有效P为15.6 mg·kg^-1，速效K 为159 mg·kg^-1，Cd 含量为2.06 mg·kg^-1。土壤基本理化性质按土壤农化常规分析方法测定。膨润土购自燕东矿产公司，主要化学组成为：SiO2 56%，MgO1%，CaO6%，Al2O3 19%，Fe2O36%，H2O 12%，比表面积209 m²·g^-1，CEC为0.56 cmol·kg^-1。

盆栽实验水稻(Oryza sativa L.)品种为津原47，购自天津市农业科学院种子公司。大田小区实验水稻品种为湘晚灿12号，由湖南省种子管理站提供。

参照我国土壤环境质量标准(GB 15618—1995)和大田小区土壤Cd污染状况，将盆栽实验Cd 浓度设为2 mg·kg^-1，以CdCl₂·2.5H₂O 的形式加入，模拟轻度Cd污染土壤，陈化20 d。分别添加0%、0.5%、1%、3%和5%膨润土，混匀后装入塑料盆(半径为25 cm，高为21 cm)，保持田间含水量的75%，平衡20 d待用。水稻种子经浸种8 h后于40 益恒温培养箱中催芽，出芽后播种到苗床上，当秧苗长至约30 cm 高时选取健壮、均一的秧苗移栽到塑料盆内，每盆3 株，于自然光照及温度条件下生长，每日用蒸馏水补充水分，60 d后测定水稻幼苗叶片生理生化特征，140 d成熟后采集水稻各部分样品和土壤样品，每个处理3次重复。

每30 m²划为一个小区，膨润土施加浓度分别为0、0.5%、1%和1.5%(按0~20 cm 表土质量计算，每个小区需分别加入0、22.5、45.0 kg 和67.5 kg 膨润土)，每个处理6次重复。施入膨润土60 d后插秧，按照稻田日常管理，水稻成熟期采样测定。

称0.2 g新鲜水稻幼苗叶片(按鲜重计)，液氮粉碎，加3 mL 预冷的0.05 mol·L^-1 磷素缓冲液，于冰浴中研磨，定溶5 mL，在4 益、13 000 r·min^-1条件下离心30 min，上清液测定各项指标^{[8, 14]}。SOD 酶活性测定参照氮蓝四唑(NBT)法，在560 nm 波长下测定光密度，单位为kU·g^-1。POD 酶活性测定采用愈创木酚法，以470 nm 波长下测定光密度，单位为U·g^-1·min^-1。MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，单位为滋mol·mg^-1。可溶性蛋白(SP)采用考马斯亮蓝法测定，单位mg·g^-1。

采用Tessier 等方法测定土壤样品中Cd 形态。采用8 mL 1.0 mol·L^-1 MgCl₂ 提取1 h，获得交换态(soluble and exchangeable fraction,SE)；采用8 mL 1.0mol·L^-1 NaAc(pH=5.0)提取5 h，获得碳酸盐结合态(bond to carbonate or weakly specifically adsorbed faction,WSA)；采用20 mL 0.04 mol·L^-1 NH₂·HCl(pH=2.0)96 益下提取6 h，获得铁锰氧化物结合态(bond toFe-Mn oxides fraction,OX)；采用3 mL 30% H₂O₂和20% HNO₃(pH 值=2.0)在85 益提取2 h，加入3 mL30%H₂O₂(pH=2.0)85 益提取3 h，然后加5 mL 3.2 mol·L^-1 NH₄Ac 和20% HNO₃ 调整到20 mL 常温下提取0.5 h，获得有机结合态(bond to organic matter,OM)，以差减法获得Cd残渣态(residual,RES)含量。

采用2,3,5-三苯基四唑氯化物显色法(TTC 法)测定过氧化氢酶活性，于波长485 nm 处比色，单位为mL·g^-1·h^-1[15]。

采用苯酚-次氯酸钠比色法测定脲酶活性，于波长578 nm处比色，单位为NH₄-N mg·g^-1·h^-1[15]。采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活性，于波长508 nm处比色，单位为mg·g^-1·h^-1[15]。

将收获的水稻分为根、茎、叶和糙米，用自来水充分冲洗以去除黏附于植物样品上的泥土和污物，然后再用去离子水冲洗，在105 益杀青10 min，然后在70益下烘干至衡重，将植物样品粉碎备用，采用HNO₃-HClO₄法消化(体积比为3颐1)，土壤样品采用HNO₃-HClO₄-HF 消解，原子吸收分光光度计(SOLAAT M6，Thermo Fisher Scientific,USA)测定。

相较于土壤中重金属总量，重金属赋存形态更能清楚反映土壤重金属污染状况，从而评估重金属迁移能力和生物有效性^[16]。一般认为土壤中各形态的Cd的生物有效性大小表现为：交换态(SE)＞碳酸盐结合态(WSA)＞铁锰氧化物结合态(OX)逸有机结合态(OM)＞残渣态(RES)^[17]。图 1 表示的是不同剂量膨润土对土壤Cd 形态含量的影响。在未添加膨润土盆栽土壤中(图 1A)，Cd形态含量高低依次为WSA(28.5%)、RES(23.8%)、SE (20.3%)、OX (17.4%) 和OM(10.1%)。随膨润土施用量的增加，土壤中SE-Cd 含量也随之降低，且较对照相比明显减少(P＜ 0.05)，降低了41.3%~86.1%。与之相对应，Cd 难容态含量逐渐增加，尤其是OX-Cd 和RES-Cd 比例总体有所上升，分别达到26.5%~39.9%和26.0%~27.1%。在大田条件下，未添加膨润土时Cd 形态比例高低依次表现为SE＞RES＞OM＞WSA＞OX(图 1B)。施用膨润土后，土壤SE-Cd 含量有所减少，与未施加膨润土对照相比，交换态(SE)Cd 分别减少了7.9%~24.6%。而OMCd和RES-Cd 含量有所增加，分别较对照增加了7.5%~29.8%和56.2%~75.2%。膨润土通过离子交换、表面络合、层间水解沉淀、表面吸附等机制作用于重金属离子^{[8, 18]}，促进Cd 由活性较高的形态向活性低的形态转化，从而降低其有效性。这与吕高明等^[19]的研究结果相一致，SE-Cd 和WSA-Cd 含量随膨润土施用量的增加而降低，最大分别可降低7.8%和1.0%，而OX-Cd、OM-Cd 和RES-Cd 含量则不同程度上有所增加，分别提高了0.2%~0.7%、1.6%~2.1%和3.9%~6.3%^[19]。前期研究也发现，投加0.5%~5%膨润土时，可交换态Cd 和Pb 含量分别减少了11.1%~42.5%和20.3%~49.3%^[8]。另外，将膨润土与其他修复材料复配处理能够协同钝化修复效果，膨润土-鸡粪复配处理下，土壤Cd 有效态和可交换态含量分别较对照降低了37.0%和12.2%，而OX-Cd、OM-Cd 和RES-Cd 含量分别增加5.3%、8.2%和7.3%^[20]。

图 1　膨润土对土壤Cd形态分布的影响 Figure 1　Effects of bentonite on Cd fractions

图选项

盆栽条件下，不同浓度膨润土处理下水稻各部位Cd 含量见图 2A。总体上而言，盆栽条件下水稻各部位Cd 累积量大小表现为根＞茎＞叶＞糙米，这是由于进入水稻根部的Cd 首先与植物体内蛋白质类、核酸类、多糖类等物质结合沉积在细胞壁和液泡中，部分Cd 离子通过载体蛋白、非选择阳离子通道等途径跨膜进入植物地上部，因而分配到糙米中比例较低，一般仅为整个植株的3.3%~9.7%^{[4, 21-22]}。未施加膨润土条件下，水稻糙米中Cd 含量为0.38 mg·kg^-1，超出我国食品卫生标准规定的稻米中Cd 含量限定值(0.2 mg·kg^-1)的1.89 倍。施用膨润土后，水稻体内各部分Cd含量总体上随膨润土施加量的增加而逐渐降低，与对照相比，根、茎、叶和糙米中Cd 含量分别减少了40.2%~46.0%、17.8%~49.8%、39.0%~54.2%和0.9%~71.8%，尤其是对水稻根部Cd 含量的抑制作用最为明显，从而减少Cd 在水稻地上部营养器官中的运输和积累。当膨润土施加量逸1%时，水稻茎和叶中Cd含量明显降低(P＜ 0.05)，而糙米中Cd 含量在膨润土投加量达到5%时才显著降低(P＜0.05)。当膨润土添加量达到3%和5%时，糙米Cd含量分别为0.17 mg·kg^-1和0.11 mg·kg^-1，均达到国家卫生标准。

不同字母表示不同处理间差异显著（P＜0.05），下同 图 2　不同膨润土处理下水稻体内Cd 含量变化 Figure 2　The concentrations of Cd in rice under different treatments of bentonite

图选项

在小区试验条件下，施加膨润土水稻各部分Cd含量均有所降低(图 2B)，与对照相比，根、茎、叶和糙米中Cd 含量分别减少21.5%~35.3%、36.1%~48.8%、15.5%~36.0%和24.1%~40.9%，其中，投加膨润土后糙米中Cd 含量显著降低(P＜0.05)，但施用不同膨润土后，糙米Cd 含量仍然超过国家食品卫生标准2.7~3.5 倍，其修复效果明显低于盆栽实验，这与王凯荣等^[23]研究结果较为一致，盆栽条件下，施用碱煤渣使得糙米Cd、Pb 含量显著降低，分别较对照处理降低78.6%和75.4%；施用石灰后糙米中Cd、Pb 含量分别减少47.7%和58.8%，而在衡阳大田试验点，施用碱煤渣后糙米Cd、Pb 含量降低幅度分别为39.9%和22.5%；施用石灰使得糙米Cd、Pb 含量分别降低33.8%和38.4%。这是因为盆栽实验使用清水灌溉，而大田实验采用湘江水灌溉，流域内采矿冶炼等工业活动频繁，湘江水系重金属污染问题十分突出^[24-25]，沉积物中Cd 含量高达8.6~19.4 mg kg^{-1 [26]}，其在水体污染中扮演着源与汇的作用，通过再悬浮会造成重金属的二次释放^[27]。因而，在污染源头尚未完全控制下，重金属污染农田的修复效果较为有限。

当环境中Cd 含量达到一定浓度时，就产生毒害，导致大量的ROS(活性氧，reactive oxygen species)在植物体内积累，ROS对细胞膜系统、蛋白质、核酸等生物大分子具有强烈的破坏作用，抑制各种参与植物生理生化过程的酶活性与蛋白的生物合成，从而影响植物正常生长^{[8, 28]}。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)能够清除植物体内过量的氧自由基和过氧化物，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化产物，其含量上升表明氧化胁迫产生，可溶性蛋白(SP)含量变化是外界胁迫下生物生长发育受到影响的直接指示^[29-30]。由图 3 可知，投加不同浓度膨润土，水稻幼苗叶片SOD 酶活性在一定程度上有所促进，但不明显(P＞0.05)，与对照相比，增加了0.1%~2.7%。而POD酶活性和MDA 含量表现为抑制效应，其中，在膨润土施加量达到5%和0.5%时，POD 酶活性和MDA 含量明显降低(P＜0.05)。SP含量在膨润土施加量为0.5%~3%时较对照处理增加7.7%~21.1%，且在膨润土含量为0.5%~1%时显著增加(P＜0.05)，在3%时有所抑制，但不明显。施加污染土壤修复剂后在一定程度上提高植物的抗逆性^[12]，研究发现，施用膨润土后蹋棵菜体内脯氨酸和MDA 含量均有所下降增加；施用腐植酸后明显提升豇豆叶片SOD 活性，而MDA含量比对照降低26.8%^[31]；低浓度的石灰垣活性炭施入能显著缓解Cd 对小白菜抗氧化酶系统的毒害作用^[32]。课题组前期研究表明，稻米中Cd 含量与POD 酶活性存在具有极显著负相关关系(P＜0.01)，而与叶中MDA和SP含量呈正相关关系^[29]。这是由于降低了土壤中Cd的有效性，有效减少植物对Cd 的吸收和富集，从而缓解了Cd对水稻幼苗的毒害效应。

图 3　不同膨润土处理下水稻幼苗生理生化特征 Figure 3　The physiological mechanisms in leaves of rice seedlings under the bentonite treatments

图选项

土壤酶来源于土壤中动物、植物和微生物细胞分泌物及其残体的分解物，是土壤结构、物理形状演变与保持的驱动力，可以用来反映土壤肥力状况和污染程度的重要指标之一^{[8, 15]}。在盆栽实验中，膨润土对土壤过氧化氢酶活性表现为一定程度上的明显的促进效应(P＜0.05)(图 4)，总体上随膨润土施加量的增加，呈现出先增加后降低的趋势，显示出施加膨润土能够有效降低土壤中H₂O₂的含量，维持根际和微生物的正常功能，增加植物抵抗逆环境的能力^[13]。与对照相比，盆栽和大田条件土壤过氧化氢酶活性分别增加31.8%~48.9%和16.5%~17.7%。与之相反，在盆栽实验中，土壤蔗糖酶活性较对照处理显著降低(P＜0.05)，降幅达到44.3%~52.3%；而在大田条件下，土壤蔗糖酶活性随膨润土施加量增加而减少，各处理间差异不显著(P＞0.05)。脲酶活性随膨润土施加量的增加，均呈现出先降低后增加的趋势。与对照相比，盆栽条件下，土壤脲酶活性降低7.6%~19.5%，其中膨润土浓度为1%~3%时，显著受到抑制(P＜0.05)；在大田条件下，施加3%膨润土后，土壤脲酶明显低于对照处理，3%膨润土处理后，则土壤脲酶活性显著高于其他处理，增加了15.1%~25.9%，这与贾峥嵘等^[33]研究发现膨润土的施加显著提高脲酶活性结果不同。前期研究发现，施用海泡石、膨润土、磷肥及其复配处理材料后土壤脲酶和蔗糖酶活性分别降低1.0%~23.2%和21.1%~62.5%^[13]。这可能是酶被黏粒矿物吸附后，导致一系列酶学性质和生物学稳定性变化，研究发现，矿物吸附的酶越少，酶活性降低越显著^[34]。另外由于膨润土具有很强的吸水性能，施用膨润土后土壤保水和持水能力提高，孔隙度减小，有机质分解速度变慢，使得脲酶和蔗糖酶活性降低^[35]。

图 4　不同浓度膨润土处理对土壤酶活性的影响 Figure 4　The effects of bentonite on soil enzyme activities

图选项

由表 1 可知，盆栽条件下，水稻根部Cd 含量与其他部位Cd 含量呈正相关关系，其中与茎Cd 含量、MDA 含量表现为极显著正相关关系(P＜0.01)，与叶Cd 含量和有效Cd 含量表现为显著相关关系(P＜0.05)。根系对Cd 的吸收转运能力决定了水稻地上部各营养器官Cd 含量，与此同时，水稻体内的阻控机制有效调控Cd由根向茎、叶和籽粒的转移^[21]。土壤有效Cd 含量与根Cd 和茎Cd 含量呈显著正相关关系。MDA含量与根Cd、茎Cd、叶Cd 和有效Cd 呈极显著正相关关系(P＜0.01)，可以用来评价膨润土钝化修复Cd 污染土壤修复效率的指标。然而，在大田条件下，土壤有效Cd 含量与根Cd 和茎Cd 含量呈正相关关系，与叶Cd 和糙米Cd 含量呈负相关关系，但都不明显(P>0.05)。过氧化氢酶活性与土壤有效Cd 以及茎Cd 含量之间表现为显著负相关关系(P＜0.05)，而茎Cd 与糙米Cd 含量以及脲酶活性之间表现为显著正相关关系(P＜0.05)。

表 1　不同参数间的相关性分析 Table 1　Correlation relationship of the different parameters

表选项

(1) 在盆栽和大田条件下，施用膨润土降低土壤Cd交换态含量，最大降幅分别达到86.1%和24.6%，与此同时，OX-Cd 和RES-Cd 比例总体有所上升，其中RES-Cd含量增加了26.0%~27.1%和56.2%~75.2%。

(2) 添加膨润土抑制了水稻对Cd 的吸收和转运，水稻体内各部分Cd 含量总体上随膨润土施加量的增加而逐渐降低。与对照相比，在盆栽条件下，水稻根、茎、叶和糙米中Cd 含量分别减少40.2%~46.0%、17.8%~49.8%、39.0%~54.2%和0.9%~71.8%；大田条件下分别降低21.5%~35.3%、36.1%~48.8%、15.5%~36.0%和24.1%~40.9%。

(3) 施用膨润土后一定程度上缓解了Cd 对水稻幼苗的毒害效应。SOD 酶活性在一定程度上有所促进，但不明显(P＞0.05)，POD 酶活性和MDA 含量表现为抑制效应，而SP 含量在膨润土施加量为0.5%~1%时显著增加(P＜0.05)。

(4) 与对照相比，盆栽和大田条件土壤过氧化氢酶活性分别增加31.8%~48.9%和16.5%~17.7%，与之相反，土壤脲酶和蔗糖酶活性总体上有所降低。