丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)是土壤微生物区系中生物量最大、最重要的成员之一，能与80%以上的陆生植物和绝大多数速生草本植物形成共生体系^{[1, 2]}。近些年来，已有一些研究表明，接种AMF可影响植物吸收多环芳烃(PAHs)，并促进土壤中PAHs去除^{[3, 4]}。程兆霞等^[5]研究得出，接种Glomus mosseae或Glomus etunicatum显著地提高了三叶草根的芘含量、积累量和根系富集系数；Gao等^[6]发现，Glomus mosseae和Glomus etunicatum促进了苊在黑麦草根中的积累，并进一步揭示了丛枝菌根中苊的亚细胞分布。已证实，接种AMF能显著地提高污染土壤中PAHs降解率，提出了PAHs污染土壤的丛枝菌根修复技术。刘世亮等^[3]发现，接种Glomus caledonium后，种植紫花苜蓿土壤中可萃取态苯并[a]芘的降解率远高于不接种土壤；李秋玲等^[1]以紫花苜蓿为宿主植物，发现接种Glomus mosseae、Glomus etunicatum、Glomus versiforme、Glomus constrictum和Glomus intraradices土壤中菲去除率均在91%以上，其机制是接种AMF 提高了土壤微生物的数量和活性，进而促进了土壤中PAHs的降解。

AMF侵染植物后，可形成根内菌丝和外生菌丝。菌丝直径约为2~27 μm，存在于土壤中的外生菌丝具有较强的穿透力，且能形成大量的分支，是直接联系土壤和植物根系的纽带^[6]。Gao等^[7]证实，AMF外生菌丝能直接从土壤中吸收PAHs，并将其传输到植物根部。球囊霉素(Glomalin)则是AMF菌丝分泌的一类含有金属离子的耐热蛋白，产生于AMF菌丝表面，能够随菌丝和孢子的脱落和降解进入土壤中^[8]。球囊霉素主要由蛋白质和碳水化合物组成，自然状态下较为稳定^[9]。研究发现，球囊霉素在保护外生菌丝被土壤微生物降解、改善土壤结构、提高土壤微生物活性、固定土壤重金属等方面具有重要作用^{[10, 11]}。然而，有关AMF影响下土壤中AMF菌丝密度和球囊霉素的响应及其与PAHs去除的关系，国内外文献报道较少。

本文以菲和芘为PAHs代表物，以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为宿主植物，研究了接种AMF下土壤中AMF菌丝和球囊霉素含量变化及其与PAHs去除的关系，试图为深入地阐明丛枝菌根修复PAHs污染土壤的规律及机理提供基础依据。

供试植物：紫花苜蓿(Medicago sativa L.)。

供试AMF菌种：幼套球囊霉(Glomus etunicatum，Ge)、摩西球囊霉(Glomus mosseae，Gm)和层状球囊霉(Glomus lamellosum，Gla)，由北京市农林科学院植物营养与资源研究所“丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)”提供。

供试土样：采自南京市江宁区旱作水稻土表层(0~20 cm)，土壤类型为黄棕壤，pH 6.02，有机质含量为24.1 g·kg^-1，砂粒、粉粒和粘粒含量分别为13.4%、61.9%和24.7%。土样采集后风干、过2 mm筛，备用。试验用沙为河沙，水洗后晾干过2 mm筛。将土壤与河沙按3：1的质量比例进行混合，多次过2 mm筛后备用。

污染土样制备^[7]：配制含不同浓度菲和芘的丙酮溶液，加入到上述土样中，待丙酮挥发后，充分搅拌混匀、过2 mm筛15次，制得含菲和芘的污染土样，置于储藏架上静置10 d后混匀、备用；测得各土样中菲和芘含量分别为41.87 mg·kg^-1和42.80 mg·kg^-1。

称取350 g污染土样于盆钵中，均匀加入20 g的AMF菌剂覆盖其上，然后再覆盖相应的100 g污染土样，加入蒸馏水至50%田间持水量。以接种灭过菌的Ge、 Gm和Gla菌剂(各6.67 g)处理为对照。紫花苜蓿种子用10%的双氧水消毒后，置于培养箱催芽，待5 d出苗后移栽到各盆钵中。一周后间苗，每盆留苗7株，生长35~75 d后收获、采样。各处理组分别接种Ge、Gm和Gla。每个处理设置3个重复。植物在温室中培养，试验期间白天温度25~35 ℃，夜晚15~25 ℃。植物生长过程中定期浇水，每周施加1次15 mL标准Hoagland营养液。采样时采集土样和植物根部样品，根样用去离子水洗净，用滤纸蘸干后立即测定侵染率等指标。

土壤中PAHs测定：依据参考文献^[12]。

菌丝密度测定：参照Jakobsen等^[13]的微孔滤膜抽滤法。首先称取5 g待测的土壤样品于500 mL的大烧杯中，之后加入250 mL水与适量土壤分散剂(六偏磷酸钠)，静置5 min后，用玻璃棒充分搅拌，悬浊液过不同孔径的多层筛子，使用蒸馏水进行洗涤。将下筛中物质冲入机械搅拌器，搅拌30 s后将悬浊液转转移到三角瓶中，吸取10 mL(分2次、每次5 mL)至0.45 μm的微孔滤膜上进行真空泵抽滤，滴加数滴曲利苯蓝溶液染色，待滤膜微干后于显微镜下观察25个视野的交叉点，即网格交叉法计算。

易提取球囊霉素提取^[14]：称取0.25 g待测土样于塑料离心管中，加入2 mL柠檬酸钠浸提剂(20 mmol·L^-1、pH 7.0)，盖紧后摇匀，置于灭菌锅(103 kPa、121 ℃)中提取30 min，取出离心管滤干外表面水分，离心6 min(转速10 000 r·min^-1)，收集上清液。

总球囊霉素提取^[14]：称取0.25 g待测土样于塑料离心管中，加入2 mL柠檬酸钠浸提剂(50 mmol·L^-1、pH 7.0)，盖紧后摇匀。总球囊霉素需要重复提取6次，每次加入浸提剂后摇匀土样，使土样与浸提剂充分接触，之后置于灭菌锅(103 kPa、121 ℃)中提取60 min，取出离心管滤干外表面水分，离心6 min(转速10 000 r·min^-1)，将表面上浮物分离并收集上清液于离心管中，4 ℃备用。

提取液中易提取球囊霉素或总球囊霉素的测定：吸取0.5 mL待测样品上清液于比色管中，加入5 mL经过过滤的考马斯亮蓝G-250染色剂，盖紧后颠倒，显色10 min并进行比色测定(波长595 nm)。测定试验前先配制牛血清蛋白(BSA)标准液，考马斯亮蓝显色后比色测定，绘制牛血清蛋白标准曲线。通过标线比照计算出土壤样品的易提取球囊霉素和总球囊霉素相关土壤蛋白含量，单位以μg·g^-1表示。

采用SPSS 12.0对数据进行统计分析，由于Ge、Gm和Gla 3个处理组中菌丝密度、总球囊霉素含量和土壤中PAHs去除率符合正态分布，因此采用Pearson相关系数表征三者的相关性强弱。同时，采用多元回归分析以表明菌丝密度和总球囊霉素含量对土壤中PAHs去除率的影响。

随着时间(35~75 d)延长，PAHs污染土壤中AMF菌丝不断增多(图 1)。接种35 d时收获的Ge、Gm和Gla菌丝密度分别为140.4、161.5 cm·g-1和146.6 cm·g-1，75 d收获时各接种处理的菌丝密度达最大值，与35 d相比分别增加了144.3%、141.4%和130.5%。不同AMF产生的菌丝密度略有差异，同一收获时间时Gm作用下土壤中菌丝密度明显高于Ge与Gla处理，55 d收获时Gm的菌丝密度相比Ge和Gla差异最显著(P < 0.05)，此时Gm的菌丝密度相比Ge和Gla分别提高了33.45%和35.02%。生长后期AMF菌丝仍有一定的延伸潜力，此时(65~75 d)菌丝密度的增长斜率仍然较高。供试时间(35~75 d)内，不接种对照处理土样中AMF菌丝密度未检出。

图 1 不同处理时间后土壤中AMF菌丝密度 Figure 1 Hyphal density of AMF in soil after 35~75 d

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接种AMF可促进土壤中易提取球囊霉素的产生，且不同AMF产生易提取球囊霉素的含量有所差异(图 2)。接种35 d后，Ge、Gm和Gla产生的易提取球囊霉素相比不接种对照处理分别提高了29.98%、32.59%和39.49%，其中Gla产生的易提取球囊霉素含量高于Ge和Gm处理；接种75 d后，Ge、Gm和Gla处理产生的易提取球囊霉素相比对照处理分别提高了48.58%、55.99%和50.23%，其中Gm产生的易提取球囊霉素含量高于Ge和Gla处理。总体来看，随时间延长(35~75 d)，土壤中易提取球囊霉素的产生量增多，表明土壤中存在易提取球囊霉素积累效应。

图 2 不同处理时间后土壤AMF易提取球囊霉素含量 Figure 2 Contents of easily extractable glomalin in soil

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接种AMF也有利于土壤中总球囊霉素的产生，且随着时间延长，各处理的总球囊霉素含量不断增加。由图 3可知，接种AMF 35 d后，对照处理、Ge、Gm和Gla处理组产生的总球囊霉素含量分别为888.5、1 160.2、1 041.8 μg·g^-1和1 061.8 μg·g^-1；接种AMF后培养75 d，这些处理的土壤中总球囊霉素含量达最大值，相比35 d时分别增加了10.13%、38.64%、60.47%和54.47%。接种后35~75 d内，Ge、Gm和Gla处理平均产生的总球囊霉素含量相比不接种对照处理分别增加了38.75%、50.95%和46.12%；其中45~75 d内，Gm处理组产生的总球囊霉素相比Ge和Gla处理分别提高了3.94%~22.50%和1.93%~11.57%。

图 3 不同处理时间后AMF总球囊霉素含量 Figure 3 Contents of total glomalin of AMF in soil

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接种AMF后随着时间延长，各处理土壤中PAHs去除率不断提高，这和土壤中菌丝密度、易提取球囊霉素和总球囊霉素含量变化的规律相一致。由图 4可见，35~75 d，接种Ge、Gm、Gla处理的土壤中菲的去除率分别达83.4%~92.7%、82.1%~93.8%、86.9%~93.4%，芘的去除率分别达42.2%~63.5%、43.7%~69.2%、44.6%~66.4%；与不接种AMF对照处理相比，接种AMF处理促进了土壤中供试PAHs的去除。接种35~75 d后Ge、Gm和Gla处理组土壤中菲的去除率比不接种AMF对照处理分别提高了2.38%~13.09%、4.29%~11.40%和2.64%~18.30%，土壤中芘的去除率则分别提高了12.52%~24.92%、15.28%~38.14%和12.30%~29.10%。

图 4 不同处理土壤中PAHs的去除率 Figure 4 Removal rates of PAHs in soil over time

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接种不同AMF处理的土壤中PAHs去除率存在差异。与接种Ge和Gla处理相比，接种45~75 d后Gm处理的土壤中菲和芘的去除率更高，这与Gm具有更强的产菌丝和产球囊霉素能力相一致。培养45~75 d，Gm产生的菌丝和总球囊霉素均高于Ge和Gla(图 1~图 3)，对应的PAHs去除率也高于Ge和Gla，该侵染时间内，Gm产生的菌丝密度相比Ge和Gla增加了13.64%~33.48%和5.62%~35.02%，产生的总球囊霉素相比Ge和Gla也增加了3.94%~22.50%和1.47%~11.57%。

为了进一步明确AMF菌丝密度、总球囊霉素含量与土壤中PAHs去除的关系，分别对Ge、Gm和Gla 3个处理组的AMF菌丝密度和总球囊霉素含量与土壤中PAHs去除率进行了相关性分析和回归分析。相关性分析结果见表 1。在Ge、Gm和Gla处理组中，AMF菌丝密度和总球囊霉素含量与土壤中菲和芘去除率之间具有极显著的正相关关系。回归分析结果见表 2。可用线性方程拟合接种AMF处理的土壤中PAHs去除率与菌丝密度、总球囊霉素含量的关系，表明，接种AMF提高了土壤中AMF菌丝密度和球囊霉素含量，并促进了土壤中PAHs的降解和去除。

表 1 接种AMF处理的土壤中菌丝密度、总球囊霉素含量与PAHs去除率的Pearson相关系数 Table 1 The Pearson correlation coefficient between hyphal density and PAHs removal rate, total glomalin and PAH removal rate in soils with AMF inoculation

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表 2 接种AMF处理的土壤中PAHs去除率与菌丝密度、总球囊霉素含量的回归分析结果 Table 2 Regression analysis for the correlations of PAHs removal rate with hyphal density and total glomalin contents in soils with AMF inoculation

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近些年来，一些研究表明，接种AMF提高了土壤中PAHs等有机污染物的去除效率，由此提出了丛枝菌根修复技术^[4]。3环以上高分子量PAHs一般在土壤中难于降解、易持留，可长期危害农产品安全和人类健康；如何强化这类PAHs在土壤中的降解一直受到研究者的关注。Joner等 ^[15]采用三叶草和黑麦草为宿主植物，研究了其对两种工业污染土壤的修复作用，发现接种AMF后土壤中PAHs去除率提高。其他学者得出了相似的结论^[5]。本研究结果也发现，接种Ge、Gm和Gla促进了种植紫花苜蓿土壤中菲和芘的去除。然而已有文献证实，植物吸收积累并非是丛枝菌根修复PAHs污染土壤的主要机制，其对土壤中PAHs去除的贡献很小^[3]；而AMF作用下良好的菌根际环境提高了土壤微生物对PAHs的降解作用，这应是接种Ge、Gm和Gla促进土壤中菲和芘去除的主要机理。

AMF菌丝的产生有利于土壤中PAHs的运输，且AMF菌丝密度的增加可促进PAHs污染土壤的修复效果。前期的研究发现^{[1, 4]}，AMF根外菌丝可以吸收污染土壤中的菲和芘，且菌丝更易吸收低分子量的菲，由于菌丝的作用使得植物菌根可吸收更多的土壤PAHs，同时通过菌丝释放的大量分泌物也提高了土壤中微生物的数量和活性，促进微生物降解PAHs^[4]。本文结果显示，接种Ge、Gm和Gla后产生的外生菌丝促进了土壤中PAHs的降解，接种AMF处理的土壤PAHs去除率高于不接种对照处理。45~75 d内Gm处理的菌丝密度显著高于Ge和Gla处理，其对应土壤中菲、芘的去除率也比Ge和Gla处理要高；这是因为外生菌丝能不断延生并产生庞大的菌丝网，AMF通过菌丝网强大的吸附能力与桥梁作用来吸收土壤中的PAHs^[16]，将其转运到植物体内，AMF自身也可将吸收的部分污染物转化为自身的养分源^[5]，同时，与Ge和Gla相比，Gm能产生更多的外生菌丝，从而增加了其与土壤PAHs的接触面积，通过向土壤中输送大量分泌物提高了土壤中微生物数量和活性，促进了土壤中PAHs降解。

接种AMF能够在土壤中产生大量球囊霉素；然而，有关球囊霉素与土壤中PAHs等有机污染物环境行为的关系，国内外至今少有报道。1996年，Wright等^[11]首次从土壤中提取并发现了球囊霉素，这也是迄今发现的唯一一类由AMF产生并释放到土壤中的蛋白质；后来，Rillig^[17]和Lovelock等^[18]进一步将其命名为球囊霉素相关土壤蛋白(Glomalin related soil protein，GRSP)。Driver等^[19]发现，球囊霉素不会直接释放到土壤中，而是牢牢地固定在菌丝细胞壁和真菌孢子中，并随着二者衰亡和降解后进入土壤。球囊霉素难溶于水，不被蛋白酶水解、难于降解，在土壤中含量丰富、且自然状态下极为稳定。近年来，土壤中球囊霉素的生态和环境效应备受学者关注。据报道，AMF产生的球囊霉素是土壤有机质的主要成分之一，也是土壤碳氮的重要来源^{[10, 17]}。本研究发现，土壤中球囊霉素含量与PAHs去除间存在显著正相关关系，这主要与以下因素有关：接种AMF后土壤中球囊霉素含量增加有利于植物生长，促进了植物释放根系分泌物，进而提高了土壤微生物的数量和活性^[14]；AMF侵染产生的球囊霉素可以保护菌丝免受外界环境的侵袭^[10]，这种保护机制可以间接促进菌丝对土壤中污染物的吸收和运输，并促进菌丝向土壤中输送分泌物，有利于微生物数量和活性的提高，进而提高了土壤中PAHs的去除效率。

(1) 接种AMF可在土壤中产生大量菌丝和球囊霉素。与不接种对照相比，75 d时接种Ge、Gm、Gla处理的土壤中易提取球囊霉素含量提高了48.58%、55.99%和50.23%，总球囊霉素含量则提高了38.75%、50.95%和46.12%。

(2) 接种AMF促进了土壤中菲和芘的去除。35~75 d，接种Ge、Gm、Gla处理的土壤中菲的去除率分别高达83.4%~92.7%、82.1%~93.8%、86.9%~93.4%，芘的去除率达42.2%~63.5%、43.7%~69.2%、44.6%~66.4%。

(3) 接种Ge、Gm和Gla处理土壤中AMF菌丝密度、总球囊霉素含量与土壤中菲和芘的去除率之间存在极显著正相关关系。