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  农业资源与环境学报  2016, Vol. 33 Issue (3): 262-267

文章信息

杨继业, 崔冠慧, 习彦花, 李亚冰, 张根伟, 张丽萍, 程辉彩
YANG Ji-ye, CUI Guan-hui, XI Yan-hua, LI Ya-bing, ZHANG Gen-wei, ZHANG Li-ping, CHENG Hui-cai
产黄纤维单胞菌CR-14菌株诱变选育及发酵条件优化
Screening and Mutation Breeding of the Celloulonmonas flavigena CR-14 and Optimization of Its Fermentation Conditions
农业资源与环境学报, 2016, 33(3): 262-267
Journal of Agricultural Resources and Environment, 2016, 33(3): 262-267
http://dx.doi.org/10.13254/j.jare.2015.0269

文章历史

收稿日期: 2015-11-11
产黄纤维单胞菌CR-14菌株诱变选育及发酵条件优化
杨继业, 崔冠慧, 习彦花, 李亚冰, 张根伟, 张丽萍, 程辉彩     
河北省科学院生物研究所, 河北 石家庄 050081
摘要: 为提高产黄纤维单胞菌CR-14纤维素酶活力,对菌株进行亚硝酸、紫外线及复合诱变处理,筛选产纤维素酶活较高的突变株,并对其发酵条件进行优化。结果表明,经亚硝酸和紫外线复合诱变得到一株产纤维素酶活较高的菌株Y-UA-18,其酶活力为10.57U,为原菌株产酶活力的1.67倍。通过正交试验得到菌株Y-UA-18产酶最佳培养基为:秸秆粉1.0%、复合氮源0.6%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%、NaCl0.08%;最佳培养条件为:初始pH值7.0、培养温度30℃、发酵时间3d。通气量对菌株Y-UA-18产酶影响不明显,但在厌氧条件下发酵液酶活显著降低,0.1%TW-80对菌株Y-UA-18的产酶没有影响。
关键词: 产黄纤维单胞菌     纤维素酶     诱变     发酵条件    
Screening and Mutation Breeding of the Celloulonmonas flavigena CR-14 and Optimization of Its Fermentation Conditions
YANG Ji-ye, CUI Guan-hui, XI Yan-hua, LI Ya-bing, ZHANG Gen-wei, ZHANG Li-ping, CHENG Hui-cai     
Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang 050081, China
Abstract: The Celloulonmonas flavigena CR-14 was screened from the rumen of cattle, which had the ability of producting cellulose and was stored in our laboratory. In order to improve the cellulose activity of the CR-14, it was treated with nitrite, ultraviolet(UV) and complex mutagenesis. Initial selection identified 6 cellulase-producing strains, as demonstrated by their ability to turn Congo red plates yellow. These 6 strains were then rescreened by determining the cellulase activity of broth. Finally, through nitrite and UV mutagenesis,Y-UA-18 strain with the high cellulose yield and stable characteristics, which enzymatic activity was 10.57 U, 1.67 times of starting strain CR-14, was screened out. In order to provide a theoretical reference to the industrial production of the strain Y-UA-18, we conducted the single factor test and orthogonal test to the fermentation medium components and the fermentation conditions. The results showed that the best medium of strain Y-UA-18 enzyme production was as followed:straw powder 1.0%, nitrogen source 0.6%, MgSO4 0.1%, KH2PO4 0.1%, NaCl 0.08%. The optimum fermentation conditions were:initial pH 7.0, incubation temperature 30 ℃, fermentation time 3 d, the effect of ventilation for strain Y-UA-18 enzyme production was not obvious, but under the condition of anaerobic, the enzyme activity of fermentation liquor was reduced, 0.1% TW-80 had no effect for enzyme production.
Key words: celloulonmonas flavigena     cellulase     mutation     fermentation conditions    

我国每年产生秸秆约6亿t,约占全世界总量的25%,大部分秸秆被焚烧,不仅污染环境,同时也造成了资源浪费[1]。目前利用秸秆厌氧发酵产沼气,可以回收高达52 %的能源,既高效利用资源又减少了环境污染,因此具有较高的发展潜力[2]。 秸秆直接发酵产气效率比较慢,这与秸秆中纤维素含量较高有关,纤维素只有被纤维素酶水解成小分子糖才能充分利用[3, 4, 5]。产黄纤维单胞菌CR-14是本课题组从牛瘤胃中筛选的一株兼性厌氧纤维素酶产生菌,其纤维素酶活为6.31 U,可以显著促进秸秆厌氧发酵水解效率[6]。为了进一步提高菌株CR-14产纤维素酶活力,对菌株进行诱变处理,目前诱变方法主要是化学诱变、物理诱变。本文采用亚硝酸、紫外线诱变[7]及复合诱变对CR-14进行菌种改良。为了对后续产业化生产提供理论依据,本文并对诱变选育出的高效菌株进行发酵条件优化。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试菌株

产黄纤维单胞菌CR-14菌株:河北省科学院生物研究所微生物室保藏。

1.1.2 培养基

初筛培养基(g·L-1)[6]:刚果红 1.5、CMC-Na 5.0、MgSO4 0.5、K2HPO4 10.0、(NH4)2SO4 2.0、NaCl 0.5、琼脂 15.0,pH7.2~7.4。

种子培养基:PB培养基。

发酵培养基(g·L-1)[6]:CMC-Na 10.0、蛋白胨5.0、牛肉膏 2.5、MgSO4 0.5、K2HPO4 10.0、(NH4)2SO4 2.0、NaCl 2.5,pH7.2~7.4。

1.1.3 药品及溶液配制

羧甲基纤维素钠购于天津市巴斯夫化工有限公司,其他药品均为国产分析纯。(pH 4.6乙酸-乙酸钠缓冲液;0.1 mol·L-1亚硝酸钠溶液;0.07 mol·L-1、pH 8.6 Na2HPO4缓冲液)。

1.1.4 仪器设备

MLS-3020型全自动高压灭菌锅;VS-1300U型超净工作台;SPX-250B-Z型生化培养箱;WFZ752型可见紫外分光光度计;YP-502型电子天平。

1.2 试验方法 1.2.1 CR-14菌株的诱变 1.2.1.1 菌悬液的制备

将CR-14菌株接于种子培养基,32 ℃、200 r·min-1摇床培养12 h后,用0.9%的生理盐水洗涤2次后,制备成菌悬液,调节菌液浓度约1.0 ×107 cfu·mL-1

1.2.1.2 亚硝酸诱变

吸取1 mL上述菌悬液于9 mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 4.6)中,然后按1:9的比例与亚硝酸钠溶液(0.1 mol·L-1)混匀,室温放置,每5 min取1 mL菌悬液加入9 mL Na2HPO4(0.07 mol·L-1、pH 8.6)缓冲液中,终止反应,以未经亚硝酸钠处理的菌悬液作为对照。稀释涂布,于30 ℃培养,每个处理3次重复,计算致死率和正突变率[8]

1.2.1.3 紫外诱变

吸取5 mL 1.2.1.1中菌悬液于无菌培养皿中。选用20 W紫外灯,预热30 min后,分别照射0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 s,照射距离为30 cm。然后对各个照射时间的菌悬液进行稀释涂布,避光培养,每个处理3次重复,计算致死率以及正突变率。

1.2.1.4 亚硝酸-紫外复合诱变

先选取亚硝酸诱变致死率为70%~75%的时间,对CR-14菌株进行处理,再选取紫外诱变致死率为70%~80%的时间,再对其进行紫外线照射处理,然后将处理后的菌悬液进行稀释涂布,每个处理3次重复,计算致死率和正突变率。

1.2.2 菌株的选育 1.2.2.1 初筛

将诱变处理的菌株涂布于刚果红平板上,培养2 d后,挑选菌落透明圈与直径比值较大的菌株,接种于半固体穿刺培养基中。

1.2.2.2 复筛

将初筛所得菌株和初始菌株CR-14分别接种于种子培养基中,30 ℃、200 r·min-1摇床培养36 h后,接种于发酵培养基中,经30 ℃、200 r·min-1摇床培养60 h后,将其发酵液于4 ℃、8 000 r·min-1离心10 min,然后测定上清液纤维素酶活力,试验设置3次重复[9]

酶活测定:按照中华人民共和国农业行业标准GB 20287—2006,对菌株发酵液中纤维素酶活力进行测定。将发酵液在 4 ℃、8 000 r·min-1离心 15 min,取上清液,作为粗酶液。取 4 支大试管,1支作空白对照,其余作为3个平行。样品管中加1.0 mL的粗酶液,然后4支试管分别加入4.0 mL已预热至60 ℃的CMC缓冲液,在60 ℃的水浴锅中反应20 min后,立即加入3.0 mL DNS显色剂,摇匀,向对照管中加1.0 mL的粗酶液。4支试管放在沸水浴中显色5 min后立即取出,流水冷却,以空白对照调零点,在 490 nm波长下测定样品管的OD值并记录结果。

酶活力定义:1 mL酶液在一定条件下1 min水解羧甲基纤维素产生1 μg葡萄糖为1个纤维素酶活力单位(U)。

1.2.2.3 突变株遗传稳定性

将筛选所得菌株进行连续传种8代,同时测定每代发酵液的纤维素酶活性,检验菌株产酶性状遗传的稳定性,每代实验均设3次重复。

1.2.3 培养基组成优化

前期本实验室在适宜工业生产的基础上,已对合适的碳源和氮源做了大量研究,选定1.0%秸秆粉为碳源,0.15%蛋白胨+0.15%豆饼粉为氮源,然后按正交试验表L9(34)对氮源、MgSO4、KH2PO4和NaCl进行4因素3水平试验,同时设计3次重复[10],以确定培养基最佳成分配比,如表 1所示。

表 1 发酵培养基4因素3水平试验设计(%) Table 1 The experimental design of 4 factors and 3 levels of fermentation medium(%)
1.2.4 发酵条件优化

由于前期对菌株CR-14的发酵条件进行过大量实验,诱变选育后,Y-UA-18菌株的分类地位没有改变,仍是产黄纤维单胞菌,通过正交实验确定突变菌株培养基主要成分和含量后,采用单因素实验,即可确定温度、时间、通气量以及表面活性剂Tween80等因素对菌株发酵水平的影响。因此为了简单、快捷,这里不再考虑正交实验设计。

1.2.4.1 温度和时间对产酶的影响

按5%接种量接种于上述优化的培养基中,分别于 20、25、30、37 ℃摇床培养24 h,每个处理3次重复,测定发酵液中的纤维素酶活。

1.2.4.2 初始pH值对产酶的影响

按5%接种量接种于初始 pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培养基中,30 ℃摇床培养72 h,每个处理3次重复,测定发酵液中纤维素酶活。

1.2.4.3 通气量对产酶的影响

按5%接种量分别接种于瓶装量为50、100、150 mL三角瓶中,同时按相同的接种量接种于100 mL的厌氧瓶中,充抽氮气6次后灭菌,30 ℃摇床培养72 h,每个处理3次重复,测定发酵液中纤维素酶活。

1.2.4.4 Tween80对产酶的影响

按5%接种量分别接种不添加Tween80(空白对照)、添加 0.1%Tween80,瓶装量为150 mL培养基中,30 ℃摇床培养72 h,每个处理3次重复,测定发酵液中纤维素酶活。

1.2.5 数据处理

试验数据采用SPSS Statistics 17.0软件,Duncan’s检验进行方差分析。

2 结果与讨论 2.1 CR-14菌株的诱变时间确定

图 1图 2可知,随着亚硝酸诱变和紫外诱变时间的延长,菌株的致死率也随之增高,最终达到100%。菌株的正突变率随时间延长呈现先增加后降低的趋势,在亚硝酸诱变和紫外线诱变的时间分别为15 min、50 s,正突变率达到最高,分别为9.77%、9.25%,此时菌株的致死率也较高,分别为74.71%、82.43%,这与许多研究结果一致,诱变致死率在70%~80%范围内,菌株正突变率最高,便于筛选[11],所以选取这两个时间作为复合诱变的处理时间。

图 1 亚硝酸诱变 Figure 1 The mutation effect of HNO2
图 2 紫外线诱变 Figure 2 The mutation effect of UV irradiation
2.2 诱变菌株的选育 2.2.1 菌株的筛选

表 2所示,通过初筛比较透明圈直径/菌落直径的方法,共选育出6株突变株,然后对这6株突变株进行发酵,通过测定发酵液的酶活进行复筛,得到突变株Y-UA-18产酶活力最高达10.57 U,为原菌株CR-14产酶活力的1.67倍。

表 2 各突变株的透明圈与菌落直径之比及酶活 Table 2 The ratio of transparent circle to the diameter of colonies and enzyme activity of each mutant
2.2.2 突变株Y-UA-18的遗传稳定性

为测定突变株Y-UA-18的遗传稳定性,对其进行连续传种8代,然后8代同时发酵培养,测定发酵液酶活,通过对8代发酵液酶活进行方差分析,其差异均不显著(P>0.05),如表 3所示,说明菌株的遗传性能稳定,可以作为后续试验菌株。

表 3 Y-UA-18菌株8代的产酶活力 Table 3 The activity of strain Y-UA-18 producing-enzyme of each generation system
2.3 培养基组成优化

表 4中可以看出,各因素对菌株发酵影响的主次顺序为B>A>C>D,即MgSO4对菌株Y-UA-18发酵产酶影响最为显著,这可能由于Mg2+一方面是酶的激活剂,另一方面可以维持蛋白质结构的完整性,因此对菌株的代谢具有促进作用。培养基成分最优配比为B1A2C2D3,即复合氮源0.6%、MgSO4 0.1%、NaCl 0.08%、KH2PO44 0.1%、秸秆粉1.0%。

表 4 正交实验结果及极差分析 Table 4 The result of orthogonal experiment and the analysis of extreme difference
2.4 发酵条件优化 2.4.1 温度和时间对产酶的影响

温度对菌株的生长代谢具有很大的影响,所以本试验对菌株在不同温度下进行发酵,并测定酶活,结果如图 3图 4所示。从图 3中可知,菌株Y-UA-18在30 ℃下发酵液酶活最高为170.29 U,37、25、20 ℃条件下发酵液酶活与之相比显著降低(P < 0.05),分别降低了17.65%、29.66%、46.77%。由图 4可知,不同温度条件下,前3 d时,菌株发酵液酶活随着发酵时间的延长而增强,第3 d时各温度条件下酶活均达到最高,而且发酵温度为30 ℃的酶活始终高于其他温度,最高达170.16 U。第4 d时,酶活开始降低,这可能由于菌株发生老化,从而产酶能力下降。

图 3 各温度对产酶的影响 Figure 3 Effect of different temperature on producing-cellulase
图 4 各温度条件下发酵时间对产酶的影响 Figure 4 Effect of fermentation time on producing-cellulase at different temperature
2.4.2 初始pH值对产酶的影响

将培养基初始pH值调至为5.5~7.5,考察不同起始pH值对菌株发酵产酶的影响。从图 5中可以看出,初始pH值在6.0~7.5范围内,菌株的酶活差异不显著(P>0.05)。初始pH值为7.0时发酵液的酶活力最高为172.45 U。初始pH值为5.5时,发酵液酶活为148.52 U,显著低于pH 7.0(P<0.05)。这可能由于在酸性条件下,菌株一些代谢的酶受到影响,导致菌株无法进行正常的新陈代谢,从而使发酵液中的酶活降低。

图 5 初始pH值对产酶的影响 Figure 5 Effect of intial pH value on producing-cellulase
2.4.3 通气量对产酶的影响

通气量对菌株代谢产酶的影响如图 6所示,将菌株分别接种于不同瓶装量的培养基中,结果表明瓶装量为50、100、150 mL的发酵液酶活没有显著差异(P>0.05),其中150 mL发酵液酶活略高为174.30 U。但在厌氧瓶中发酵液酶活仅为118.49 U,显著低于其他3组(P<0.05)。这可能由于菌株CR-14在厌氧条件下发酵,代谢产酸后,菌株的生长受到抑制进而产酶较低。

图 6 通气量对产酶的影响 Figure 6 Effect of different ventilation on producing-cellulase
2.4.4 Tween80对产酶的影响

表面活性剂一方面可以改变菌株细胞膜的通透性,有利于代谢产物排出;一方面可以使疏水界面压力降低,提高氧在气液界面的传输速度。由图 7可知,在培养基中添加0.1%的Tween80发酵液酶活为170.38 U,与对照相比没有显著提高(P>0.05),反而比对照的酶活略低。这可能由于添加Tween80浓度较小,菌株的细胞膜的通透性没有受到影响,代谢产物没能及时排出胞外,这需要进一步的试验验证。

图 7 吐温80对产酶的影响 Figure 7 Effect of Tween 80 on producing-cellulase
3 结论

通过对CR-14菌株进行亚硝酸诱变和紫外诱变,筛选出一株产纤维素酶活较高,且能够稳定遗传的菌株Y-UA-18,其纤维素酶活为10.57 U,为原菌株的1.67倍。通过单因素试验和正交试验确定了菌株Y-UA-18产酶最佳培养基成分配比秸秆粉1.0%、复合氮源0.6%、KH2PO44 0.1%、MgSO4 0.1%、NaCl 0.08%和最佳发酵条件初始pH值7.0,培养温度30 ℃,发酵时间3 d,为该菌种的工业化生产奠定基础。

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