草莓是多年生草本植物，呈直立或半匍匐丛状生长，进行无性繁殖。草莓果实色泽艳丽，柔软多汁，风味独特，富含维生素C和多种矿物质，有重要的保健功能和显著的经济价值^{[1, 2]}。近年来，我国草莓种植业发展迅速，栽培面积迅速扩大。但在草莓的种植过程中，连作病害严重，尤其根腐病是制约草莓产业健康发展的主要障碍^[3]。为了追求经济效益，种植户盲目过量施肥、喷药，不仅浪费资源、污染环境，而且会造成果实农药残留等后果。随着生活水平的提高，草莓优质和安全生产愈来愈受到关注，人们对草莓的需求正由单纯的数量型向质量型转变^{[4, 5]}。因此，研究草莓的生物学特性，寻找安全高效的生防制剂，对于防控草莓病害、提高草莓产量、改善草莓品质具有重要的现实意义。

近年来，国内科研人员研究报道了不同类型的生物有机肥对草莓生长及品质的影响。阎立江等^[6]研究了从培植蚯蚓中提炼出来的一种具有土壤调理作用的“荣木”液体有机肥，田间试验表明，增施该有机肥能明显促进草莓生长发育、增加产量和改善草莓品质；童晓利等^[7]报道农作物秸秆提取液——草醋液，周新伟等^[8]报道水葫芦有机肥均可促进草莓种苗生长，改善果实品质。目前，应用于草莓生产的生物有机肥最普遍的做法是利用一些活性物质与有机肥结合或者直接应用液体成品。微生物菌剂用于草莓防病促生亦有报道，申光辉等^[9]从草莓根际土壤中筛选出2株拮抗真菌Penicillium griseofulvum HF3、Aspergillus terreus HF7制成孢子悬液与病原菌一起接种于草莓根际，盆栽试验表明拮抗真菌对草莓有很好的促生效果，对根腐病的防效分别达53.0%和46.9%。2008年De C A等^[10]研究利用Penicillium oxalicum防控草莓白粉病，利用P. oxalicum的孢子悬液进行野外试验，结果表明其能有效地降低草莓白粉病的发病率，促进植株生长。虽然微生物制剂对草莓病害防控和品质改善有很好的效果，但是液体菌剂存在受货架期短、活性不稳定等问题。本研究利用PGPR菌株防控土传病害及植物促生过程中，筛选到1株生防链霉菌（S. hygroscopicus）B04（NCBI 登录号：KM 593295），实验研究发现该菌株对草莓根腐病病原菌（Fusaruim oxysporum）Y3^[11]具有较强的拮抗作用。蚯蚓粪因其在有机农业中具有独特的优势，备受国内外研究者们的青睐，它可以作为新型的育苗基质、生物肥料、生物除臭剂等。目前，国内外已经展开对蚯蚓粪的研究，Yardim等^[12]研究报道了蚯蚓粪与有益微生物结合后能降低黄瓜、番茄的连作病害，改善其品质，增加土壤肥力。而麸皮在与微生物进行发酵过程中不仅能显著提高本身的营养价值，杨旭等^[13]研究发现，麸皮在发酵过程中，本身的营养价值得到很大的提升，而且与其发酵的黑曲霉等混合菌数量也显著增加。因此，本文利用蚯蚓粪与麸皮进行发酵制备固体菌剂，研究其对草莓根腐病防控效果、对植株生长及果实品质的影响，以期为放线菌固体制剂用于草莓生产提供科学依据。

供试菌株：吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus B04（CGMCC NO.9918），尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）Y3由本实验室分离保存。

供试草莓：品种为“红颊”，草莓幼苗由南京江宁区麒麟镇草莓种植园提供。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

S. hygroscopicus B04液体种子培养基：葡萄糖 45.0 g，黄豆粉30.0 g，酵母粉5.0 g，CaCO₃ 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.5，121 ℃，灭菌20 min。

固体发酵原料：麦麸含有0.96% N，0.36% P₂O₅，0.97% K₂O，19.47%有机质；蚯蚓粪含有2.15% N，2.76% P₂O₅，1.61% K₂O，40.2%有机质，由扬州大学环境学院蚯蚓养殖场提供。

（1）B04种子液制备。菌株B04在PDA培养基斜面上活化，28 ℃培养5~7 d，待分生孢子丰满，挑取3环孢子，接种于50 mL种子培养基中（装于250 mL三角瓶），30 ℃、170 r·min^-1振荡培养48 h，3 000 r·min^-1，离心10 min，菌丝体含量20%（W/V），备用。

（2）固体发酵配方优化。采用De Wit^[14]模型，取蚯蚓粪与麦麸按质量10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10比例装入250 mL三角瓶中，每瓶所加固体发酵原料总质量为20 g，控制料水比1∶0.8，调节基质pH 7.2~7.5，121 ℃，灭菌20 min，即得不同配比的固体发酵基质，不同比例的处理各重复3次。按15%（V/W）接种量接入种子液，28 ℃培养，每日用无菌玻棒翻动2次混匀，培养5~7 d，观察瓶壁及固体培养基中长满灰白色菌丝，培养基质散发出典型的“土腥味”。将每个配方发酵的固体制剂各取10 g，置于90 mL无菌水震荡稀释，然后系列稀释至10^-9，取10^-7、10^-8、10^-9的菌悬液进行涂布计数，每个稀释梯度重复3次，对计数结果进行统计和比较，获得优化的固体发酵配方。

按优化配方配制备固体发酵基质1 000 g，灭菌，置于不锈钢浅盘中，按15%接种量接入种子液，置于28 ℃无菌室中发酵，每日用无菌玻棒翻动2次，培养7 d，测定发酵基质中菌体的数量。

试验于2014年9月至2015年1月，在南京江宁区麒麟镇后村草莓生产基地温室大棚中进行。盆栽用土取自草莓连作5年的大棚，经调查上年田间根腐病的发病率在75%以上，盆栽前经选择性培养基^[15]检测土壤中尖孢镰刀菌（F. oxysporum）数量达到10⁵ CFU·g^-1。试验设置对照、B04液体菌剂及B04固体菌剂3个处理，每个处理20盆。对照和B04液体菌剂处理中分别添加与1%固体菌剂中营养成分相当的N、P、K化学肥料，以消除与固体菌剂处理中营养成分的差异。

选取长势较好且大小一致的健康草莓幼苗，移栽至装有1.5 kg草莓连作土的盆钵中，1% B04固体发酵菌剂（15 g）提前与盆栽土混合拌匀装入盆钵中，1% B04菌悬液（15 mL，15%（W/V））用适量水稀释在草莓移栽缓苗1周后沿根灌注，每盆1株，每个处理20盆。草莓根腐病病原菌（F. oxysporum）Y3用PDA液体培养基摇瓶培养5 d后，收获分生孢子并调整其孢子浓度为10⁵ 个·mL^-1。在草莓移栽缓苗3周后，采用灌注法接种在草莓根系周围，接种量为每盆5 mL，以加强病原微生物的致病性。常规管理，定期观察记录草莓生长情况，统计发病率^[16]，在每个处理的草莓中随机挖取10株生长良好的植株进行相关指标测定。

将草莓大棚划分为6个条垅，每条垅0.5 m×15 m，每个处理2条垅，每处理种植150棵草莓苗。田间试验设计为对照、B04液体菌剂及B04固体菌剂3个处理。液体菌剂处理为每棵苗施入15 mL菌液，20%（W/V）菌丝体浓度，移栽缓苗1周后用水稀释后灌根；固体菌剂每穴施加15 g，移栽前穴施。对照和B04液体菌剂处理中分别添加与固体菌剂中营养成分相当的N、P、K化学肥料，常规管理，采样检测不同处理草莓果实品质的差异。田间试验于2014年9月至2015年4月，在南京江宁区麒麟镇后村草莓生产基地大棚中进行。

草莓幼苗移栽盆钵约3个月后，每个处理随机挖取植株10株，分别测定其茎粗、叶片数、叶片面积^[17]（每株测定3个叶片），取平均值；植株生物量，采用称重法测定生物量，叶面积用（长×宽）cm²来表示。根系特征参数用根系扫描仪测定，扫描仪型号为EPSON perfection Various V700 photo。

2015年2月，盛果期采摘各处理无病害、无生理病斑、无机械损伤的草莓果实500 g，测定草莓果实的品质。取样和测定方法均按照草莓种质资源描述规范与数据标准进行^[18]。果实硬度测定用数显式水果硬度计GY-4测定；可溶性固形物用糖度计（LB20T型）测定；有机酸采用NaOH滴定法测定；草莓果实Vc含量采用碘酸钾萃取分光光度法测定^[19]。

用Microsoft Excel 2003软件对有关数据进行分析，用SPSS19.0统计分析软件进行数据差异性检验。

实验发现，采用不同基质配比固体发酵，菌体数量差异明显。从图 1可见，当蚯蚓粪与麦麸比值增加时，菌体数量也逐渐增加，当蚯蚓粪与麦麸的质量比为5∶5、4∶6时，菌体数量达到最多，分别为8.31×10¹⁰、8.23×10¹⁰ CFU·g^-1，但两者差异不显著。然而随着蚯蚓粪质量继续减少，麦麸质量继续增加时，菌体数量却随之减少，分析原因，这可能与发酵基质中蚯蚓粪与麦麸的营养成分配比及基质的透气性有关。考虑发酵基质的成本，最终选择蚯蚓粪与麦麸质量比为5∶5作为最合适的发酵基质配比。

图 1 不同固料比对S. hygroscopicus B04 菌体数量（孢子）的影响 Figure 1 Effect of different proportion of the raw materials on the number of S. hygroscopicus B04

图选项

按优化配方蚯蚓粪与麦麸质量比5∶5，配制固体发酵基质，灭菌，置于不锈钢浅盘中，按15%接种量接入种子液，置于28 ℃无菌室中发酵培养7 d，测定发酵基质中菌体的数量为5.3×10¹⁰ CFU·g^-1。

盆栽试验结果见表 1，施用B04液体菌剂、B04固体菌剂与对照相比，草莓植株生物量显著增加。B04液体菌剂和B04固体发酵菌剂处理的草莓根鲜重分别增加41.33%和62.15%，茎叶鲜重增加30.81%和43.79%，单叶面积分别增加33.53% 和59.25%。盆栽试验结果表明，S. hygroscopicus B04可促进草莓的生长发育，尤其菌株B04的固体菌剂对草莓的促生增产作用更为显著。施用B04液体菌剂和B04固体菌剂均能减轻草莓根腐病的发病率，生防效果分别为48.00%和64.35%。

表 1 不同处理对草莓植株生物量的影响 Table 1 Effect of different treatments on biomass of strawberry plant

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草莓根系经过根系扫描仪扫描后发现，不同处理根系生长状况存在较大差异（图 2），施用B04固体菌剂处理的草莓植株根系生长最发达，B04液体菌剂次之，CK根系生长最差。从图 2可见，菌株B04能显著促进草莓根系生长发育。草莓根系相关参数测定分析见表 2，各处理间差异显著，其草莓总根长、根表面积、根体积、根尖的顺序均为：B04固体菌剂>B04液体菌剂>CK。B04固体菌剂的总根长、根表面积、根体积、根尖分别是对照的2.47、2.01、2.42、2.02倍。对于根系各参数，B04固体菌剂和B04液体菌剂要显著高于CK。说明菌种B04对草莓植株根系生长有显著的促生作用，且固体菌剂的促生作用更明显。

图 2 不同处理对草莓植株根系生长的影响 Figure 2 Effect of different treatments on root systems of strawberry plant

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表 2 不同处理对草莓植株根系特征参数的影响 Table 2 Effect of different treatments on root characteristics of strawberry plant

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盛果期采摘各处理草莓果实，检测B04制剂对草莓果实品质的影响。结果表明S. hygroscopicus B04可改善草莓果实的品质（表 3）。其中施用B04液体菌剂和B04固体菌剂与对照相比，可溶性固形物分别增加24.78%和40.00%，可滴定酸含量较对照下降16.00%和30.67%，维生素C增加16.55%和24.01%，说明菌株B04能提高草莓果实的糖酸比，且固体菌剂表现出更显著的效果。施加B04液体菌剂处理，草莓硬度较对照下降3.70%，而B04固体菌剂与对照相比，硬度增加1.85%。表明B04固体菌剂能适度地提高草莓硬度，降低了草莓运输较难的现实问题。

表 3 不同处理对草莓果实品质的影响 Table 3 Effect of different treatments on fruit nutrient quality of strawberry

表选项

微生物制剂施入土壤后，在土壤-植物-有益菌系统内发生一系列复杂的化学、生理、生态反应，近年来，施用微生物制剂促进草莓生长，提高草莓果实品质备受关注^{[20, 21]}。放线菌具有适应环境能力强，在植物根表和根围土壤中有较强的定殖能力，能产生抗生素，分泌多种胞外水解酶^[22]，能产生丰富的分生孢子，且孢子存活时间长，有利于工业化生产及应用等优点，但是生防菌株必须与一种合适的载体结合到一起，才能更好地提高它对土传病害的防控^[23]，故利用放线菌进行固体发酵制成生防制剂来防控连作障碍、促进植株生长、改善作物品质具有更重要的意义。目前，关于生物有机肥或微生物制剂用于防控土传病害，改善作物品质，提高作物产量已有很多研究报道。如王勇等^[24]用蜡质芽孢杆菌AR156防治辣椒青枯病，温室防效高达73.31%，并使辣椒植株干重增加22.30%；李鸣雷等^[25]研究用生物有机肥能改善大豆品质，提高大豆产量等。生物有机肥或微生物制剂是防控作物土传病害，提高作物品质的主要机制，能改善作物根际微生物区系，促进植物根系生长，良好的根系形态又可以促进植物对养分的吸收，从而提高作物自身品质^{[26, 27]}。目前国内尚未有利用吸水链霉菌进行固体发酵制成菌剂来防控草莓土传病害，促进草莓生长、改善草莓品质、提高草莓产量的研究报道。拮抗菌B04是实验室前期筛选到的1株生防效果优良的放线菌，对多种植物病原真菌均有较强的抑制作用，本试验将吸水链霉菌B04作为生防菌，以蚯蚓粪与麦麸（1∶1）为发酵基质，发酵制备S. hygroscopicus B04固体菌剂，为草莓根腐病害生物防控提供新的生防材料。盆栽试验表明，施用B04固体菌剂可增加草莓植株生物量，对草莓生长有显著的促进作用，并对根腐病有一定的防控效果。同时田间试验还表明，B04固体菌剂能提高草莓果实的Vc含量，增加草莓果实的糖酸比，适度的增加草莓的硬度，从而改善了草莓的品质。此研究为S. hygroscopicus B04固体菌剂在草莓有机种植中的推广应用提供理论支持。

（1）S. hygroscopicus B04固体发酵基质最佳配比是蚯蚓粪与麦麸1∶1，28 ℃，发酵周期7 d，菌体（孢子）数量达到5.3×10¹⁰ CFU·g^-1；

（2）B04固体发酵菌剂可降低草莓根腐病的发病率，生防效果达到64.35%，显著促进草莓生长，改善草莓品质。