磷素是植物必需营养元素之一，是植物体内核酸、核蛋白和磷脂等重要化合物的组成成分，在能量转换、呼吸和光合等代谢活动中起着重要作用，对提高植物抵御干旱、低温和盐碱等胁迫能力方面也发挥着十分重要的作用^{[1, 2]}。

植物体内磷主要以有机磷如核酸、磷脂、植素等的形态存在。植株样品中有机磷经干灰化或湿灰化分解转变为无机正磷酸盐。植株全磷测定消煮方法常用H2SO4-H2O2消煮分解样品制备待测液，待测液中磷酸盐用钒钼黄比色法和钼蓝比色法测定^[3]。钒钼黄比色法基于的原理是一定浓度范围（1~20 mg P·L^-1）内的磷酸盐与偏磷酸盐和钼酸盐在酸性条件下可形成黄色杂聚化合物——磷钼杂多酸，溶液黄色其深浅与磷含量呈正比；钒钼黄比色法广泛用于植物和有机肥料样品中磷的测定。钼蓝比色法原理是在一定酸度条件下，磷酸盐与钼酸络合形成的磷钼杂多酸Mo6+，被还原剂还原为Mo⁵⁺，生成一种叫做“钼蓝”物质^{[3, 4]}。

利用钼蓝比色法原理结合连续流动分析仪（Continuous Flow Analyzer，CFA），可用来测定样品中磷酸盐^{[5, 6, 7, 8]}。连续流动分析仪主要由自动进样器、蠕动泵、化学分析模块、比色计和数据处理系统组成^[9]。按预先设定的取样程序，准确将样品取出，通过蠕动泵精确定量输送样品和试剂，按顺序定量注入到化学反应模块中，同时均匀注入空气气泡，将每一个样品分割。样品和试剂在化学分析模块中经过惰性玻璃圈上下旋转混合，经过透析器被过滤和稀释后，显色液体进入比色计中进行比色^{[9, 10, 11]}。比色后检测器将信号传入电脑，最后通过软件进行数据处理，无需烦琐的手工比色过程，分析人员只需配制显色试剂、编辑测定程序、整理结果报告，将复杂的手工操作简化成仪器的自动化与批量检测，分析速度明显加快^{[6, 7]}。另外样品待测液在设定的一致条件（进样速度、显色时间、显色温度、清洗比）下反应，减小了人为操作误差^{[6, 7, 12, 13]}。张英利等^[14]利用连续流动分析仪测定硫酸-过氧化氢消解小麦样品中磷含量，加标回收率98.5％~100.5％，相对标准偏差小于2％。贝美容等^[15]通过改进AA3型连续流动分析仪所附试剂配制方法，实现对橡胶叶片H₂SO₄-H₂O₂消煮液中的氮、磷、钾含量同时测定；他们计算假设用于配制标准溶液及各种试剂时间大约为4 h，用于仪器预热及样品消煮液的稀释时间为3 h，若每小时测定50个样品，13 h（相当于1.5 d时间）内可测定300个样品。连续流动分析仪方法明显快速高效、省力。但是连续流动分析仪带来测定自动化同时也带来操作上不稳定性，利用连续流动分析仪测定玉米植株秸秆和籽粒全磷含量，与常规的钒钼黄比色法相比，是否存在差异，尚未见相关报道。

本文选择69个玉米秸秆和籽粒样品，利用H2SO4-H2O2消煮，消煮液中磷含量采用连续流动分析仪测定，与钒钼黄比色法测定结果相比较，探讨采用连续流动分析仪测定玉米植株全磷含量的可行性。

玉米茎秆和籽粒样品采自黑龙江省哈尔滨市民主乡，样品烘干后粉碎过0.50 mm筛。

参照文献[3]方法，称取0.25 g（精确至0.000 1 g）干燥样品，送入消煮管中，加入5 mL浓硫酸，摇动使硫酸与样品混匀，静置过夜，次日利用自动程序消解系统（AIM600，Aim Lab Automation Technologies Pty Ltd.，Australia）加热，升温速度5 ℃·min^-1，升温至200 ℃，保持30 min，继续加热至300 ℃，瓶内硫酸开始冒白烟后15 min取下消煮管，稍冷却，滴加30%过氧化氢，不断摇动消煮管，继续加热15~20 min，如瓶内溶液仍有黑色或棕黄色，则在消煮管稍冷后，再滴加过氧化氢，随后再加热，如此反复处理3~5次，直至瓶内溶液完全清亮无色为止。然后再加热10 min，除去过量过氧化氢。消煮完毕后，定容至100 mL。

紫外可见分光光度计（UV2700，Shimadzu Scientific Instruments公司）。

吸取消煮待测液25 mL，置于50 mL容量瓶中，加2，6-二硝基酚指示剂2滴，用6 mol·L^-1 NaOH溶液中和至刚呈黄色，加入钒钼酸铵试剂10.00 mL，用水定容。放置15 min后，在紫外可见分光光度计波长450 nm处比色。标准曲线：分别吸取50 mg·L^-1 P标准溶液配置0、2、4、6、8、12 mg·L^-1浓度标准P溶液，按照上述条件进行测定。钒钼酸铵试剂配置：25.0 g钼酸铵溶于400 mL去离子水中；1.25 g偏钒酸铵溶于300 mL沸水中，冷却后加250 mL硫酸；将钼酸铵液缓缓注入偏钒酸铵液中，搅拌均匀，稀释至1 L。

连续流动分析仪（Auto Analyzer 3 System，SEAL Analytical GmbH公司），配置有MT8化学模块、操作软件AACE。其测定磷浓度的原理流路如图 1所示。

图 1 连续流动分析仪MT8 模块测定磷酸盐原理流路图 Figure 1 Flow scheme of P determination by MT8 module in continuous flow analyzer

图选项

（1）钼酸铵：溶解6.2 g钼酸铵、0.17 g 酒石酸钾锑，溶解稀释至1 L，储存于棕色瓶中。（2）抗坏血酸：15 g抗坏血酸溶于600 mL去离子水，稀释至1 L。溶液混匀，储存于棕色瓶中。（3）酸：14 mL硫酸至600 mL去离子水中。冷却至室温后稀释至1 L，加入1 g十二烷基硫酸钠并混合均匀。（4）酸盐：5 g 氯化钠溶于700 mL去离子水，加入12 mL硫酸，溶液混匀并稀释至1 L，再加入1 g十二烷基硫酸钠并混合均匀。（5）清洗液：5%硫酸。

选择防酸进样针和高浓度进样管，设置进样速率60样·h^-1，进样与清洗比为3.0∶1，进样时间45 s，清洗时间15 s。仪器默认设置基线和漂移校正，自动基线参比为4％；比色滤光片波长为660 nm，灯强度大于1 000 mV。

用磷酸二氢钾配制浓度1 000 mg·L^-1的P标准贮液，测定时配制0、2、4、6、8、10 mg·L^-1浓度标准P溶液，按照上述条件进行测定，仪器测定峰高与标准溶液P浓度之间进行线性回归，制作校准曲线如图 2所示，相关系数r=0.999 9。

图 2 连续流动分析仪测定磷的标准曲线 Figure 2 The standard curve for P concentration determination by continuous flow analyzer(CFA)

图选项

采用标准加入法，分别称取2份0.25 g（精确至0.000 1 g）干燥植株样品，送入消煮管中，在其中一份加入已知磷浓度的磷酸二氢钾标准液，按照1.2设定条件进行消煮，利用连续流动分析仪测消煮液磷浓度，分别得到加标植株样品磷浓度和植株样品检测磷浓度，仪器测定的磷标准回收率=（加标植株样品磷测定值-植株样品磷测定值）×100。

69个植株样品消煮液分别用连续流动分析仪和钒钼黄比色法测定，测定数据间差异显著性采用Excel软件中分析工具库 t-检验，进行成对双样本均值分析；测定数据之间进行相关分析，利用直线方程进行回归，并统计分析相关系数的显著性。

连续流动分析仪测定植株磷含量重复性实验选择 4个植株样品消煮液，每个消煮液重复测定10次。测量值Xi的算术平均值为样品全磷估计值，标准偏差用贝塞尔公式计算，即：

相对标准偏差（RSD）=标准偏差/计算结果算术平均值×100%。

连续流动分析仪和钒钼黄比色法对开花期玉米秸秆全磷含量测定结果范围分别为2.33~3.19 g·kg^-1和2.33~3.28 g·kg^-1，平均值分别为2.76 g·kg^-1和2.84 g·kg^-1；收获期玉米秸秆中全磷含量分别为 0.54~1.27 g·kg^-1和0.59~1.49 g·kg^-1，平均值分别为0.89 g·kg^-1和0.96 g·kg^-1；收获期玉米籽粒中全磷含量分别为 2.06~3.11 g·kg^-1和2.35~3.47 g·kg^-1，平均值分别为2.40 g·kg^-1和2.71 g·kg^-1。收获期秸秆中全磷含量明显降低（图 3）。69个样品2种方法的测定结果无显著差异，t 检验的双尾P值小于0.01（表 1）。

图 3 连续流动分析仪和钒钼黄比色法测定植株全磷含量结果比较 Figure 3 Comparison of total P contents in maize determined by CFA and VMTC method

图选项

表 1 t检验-成对双样本均值分析玉米植株全磷含量测定结果 Table 1 Paired samples t-test for the measured values of maize plant P contents by CFA and VMYC method

表选项

将连续流动分析仪和钒钼黄比色法对69个样品全磷含量测定结果进行相关性分析（图 4），2种方法测定结果呈极显著的线性相关关系，相关系数r=0.985（n=69，P<0.01）。2种方法测定数据之间回归直线方程为Y（连续流动分析仪-P）=0.927X（钒钼黄比色法-P）-0.002。线性方程斜率为0.927，表明连续流动分析仪测定的植株全磷含量略低于钒钼黄比色法。

图 4 连续流动分析仪和钒钼黄法测定玉米植株全磷含量结果间相关分析 Figure 4 Relationship between total P contents in maize plant determined by CFA and VMYC method

图选项

用标准加入法进行回收率测定实验，选择2份植株样品，分别添加3 mg·L^-1和5 mg·L^-1磷标准溶液，消煮后，利用连续流动分析仪分别测定3次。结果表明连续流动分析仪测定磷标准回收率为99.3%~103.8%（表 2）。

表 2 连续流动分析仪测定磷标准回收率结果 Table 2 Recovery rate of P added to plant samples determined by CFA

表选项

在相同测量条件下，利用连续流动分析仪对4个样品消煮液中磷含量分别进行了10次测量，测定结果重复性较好，相对偏差在0.66%~1.40%范围内，均小于1.5%（表 3）。

表 3 连续流动分析仪对玉米植株消煮液中磷浓度的重复性测定结果 Table 3 Results of precision of P concentrations in maize plant digests determined by CFA

表选项

与常规钒钼黄比色法相比，连续流动分析仪测定玉米植株中全磷含量无明显差异，可用回归直线方程为Y（连续流动分析仪-P）=0.927X（常规钒钼黄比色法-P）-0.002描述，相关系数r=0.985（n=69，P<0.01）。连续流动分析仪分析植株样品磷含量的相对标准偏差小于1.5%，回收率在99.3%~103.8%之间。连续流动分析仪法具有分析速度快、消耗试剂少等优点，适于大批量H₂SO₄-H₂O₂消煮的植株样品中磷含量分析。