黄顶菊（Flaveria bidentis）又称二齿黄菊，属菊科堆心菊族黄菊属，原产于南美洲，主要分布于西印度群岛、墨西哥和美国的南部，后来传播到非洲的埃及和南非、欧洲的英国和法国、澳大利亚和亚洲的日本等地^{[1, 2]}。2001年黄顶菊在我国的天津市和河北衡水市首次发现，传入年份及传入途径不祥^[3]。黄顶菊入侵我国后依靠其强大的适应性迅速传播，通过竞争或占据生态位来排挤本地植物，形成大面积单优群落，导致植物群落结构简化、物种多样性降低和生态系统功能的衰退^[4]。有机体中氮磷比的相对恒定是植物生存的重要适应性机制，通过N、P添加试验可以进一步验证氮磷比的相对恒定的假说。目前，对黄顶菊的研究主要集中在其生理形态特征^{[5, 6]}，生物防治^[7]，化感作用^{[8, 9, 10]}，入侵后土壤微生物的变化^{[11, 12]}，替代控制^{[13, 14]}等领域。

近年来，生态化学计量学理论的迅速发展和不断完善为研究土壤养分供应平衡和植物体元素组成平衡提供了一种新的思路。该理论认为有机体组成元素的比值决定其关键生物学特征和主要生态功能^{[15, 16]}，因此探讨入侵植物黄顶菊叶片N、P化学计量特征，可为研究元素在生物地球化学循环和生态过程中的计量关系和规律提供一种综合方法，也可为植物器官功能性状的生态调控提供一种视角。叶绿素是衡量叶片光合能力的一个重要功能性状，其主要受到土壤和叶片养分元素的影响。王满莲等^[17]研究了土壤养分添加对叶片叶绿素含量的影响，但目前有关叶绿素含量对叶片元素响应的研究则很少有人涉及。研究黄顶菊对N、P添加的生理生态响应将有助于阐明黄顶菊入侵与土壤养分状况的关系及限制因子，为探究可能采取养分调控来防控黄顶菊策略提供参考。

本试验拟以外来入侵植物黄顶菊（Flaveria bidentis）为研究对象，通过向土壤中添加不同N、P水平的盆栽试验，研究土壤和叶片N、P化学计量特征与其主要功能性状（叶绿素含量）间的关系，试图验证：（1）土壤中氮磷含量对黄顶菊叶片中N、P化学计量特征的影响；（2）土壤和叶片N、P化学计量特征对黄顶菊叶片主要功能性状（叶绿素）的影响；（3）不同土壤养分条件下，黄顶菊对于生长速率假说的适用性。 1 材料与方法 1.1 研究区概况

试验地位于农业部环保所网室内（39°05′804″N，117°08′805″E，海拔4 m），该区域年平均降水量为550～680 mm，年平均气温12.3 ℃。试验材料黄顶菊种子采集于河北省献县陌南村（38°15′30″N，115°57′50″E，海拔5 m），为黄顶菊重发生区。为提高实验中N、P 在土壤中的扩散和渗透，使N、P在土壤空间分布均匀，盆栽基质为混合均匀的网室试验土壤与河沙（质量比为3∶1），每盆基质重量为8 kg，塑料盆规格为38 cm×35 cm（盆高×口径）。试验前土壤基础理化性质为：土壤pH值7.88，全N含量为1.04 g·kg^-1，全P含量为0.62 g·kg^-1。 1.2 试验设计

于2012年6月上旬播种黄顶菊种子，在苗高5 cm时选取长势一致的植株每盆定苗1株。随后开始N、P添加实验，以原盆栽土壤为对照（1N1P），向盆中施入NH₄NO₃和KH₂PO₄肥料，施入量分别为土壤全N和全P含量的2倍（2N2P），以此类推，2N3P、2N4P、3N2P、3N3P、3N4P、4N2P、4N3P、4N4P，共10个处理，见表 1。每个处理10次重复，共100盆。研究目的主要在于考察N、P不同施用水平对黄顶菊化学计量特征及其主要功能性状的协同影响，考虑到农业生产实际，并未设单施N、P处理。根据土壤中的全N、全P的含量计算各组合应添加NH4NO3和KH2PO4的量（用精确度为0.01 g电子天平称取），充分溶于等量水中后浇于盆中，分2次均等添加，时间相隔7 d。试验期间适时适量浇水，每盆底下放置1只托盘，每次浇水时用清水清洗托盘内部，并将水倒入盆中，以防止盆土中营养的流失。N、P添加45 d后用混合取样法取各重复的正常叶片约20片放入低温采样箱带回实验室处理。同时用采样器取0～10 cm表层土壤，样品均带回实验室处理^[18]。

表 1 各组试验土壤的N、P水平及N∶P Table 1 N,P levels and N∶P ratio of soil in different treatments

表选项

叶片N、P养分元素测定：植物样品105 ℃杀青30 min，然后65 ℃烘干至恒重，叶片粉碎过100目筛，混匀后保存在纸袋中以备分析。土壤样品经自然风干后过100目孔筛。植物和土壤有机C测定采用重铬酸钾外加热法，全N用凯氏定氮法，全磷用钼锑抗比色法测定^{[18, 19]}。

叶绿素含量测定：每个处理随机选取黄顶菊3株，每株选择中上部正常生长且叶位相同的3片成熟叶。采集的鲜叶带回实验室后，用去离子水清洗干净，擦干后，用打孔器切取1 cm²左右叶片（避开比较粗大的叶脉），切成长约5 mm、宽约1 mm 的细丝，然后用80%的丙酮浸提至细丝完全变为白色为止（过夜即可），于663 nm和645 nm处读光密度（OD），按照以下公式计算单位面积的叶绿素含量（CA，mg·dm^-2）^[20]：

提取液的叶绿素质量浓度CV=Chl a＋Chl b（CV，μg·mL^-1）；

单位面积表示的叶绿素含量（mg·dm^-2）：CA= CV×1/1 000×5×100/S=0.5 CV/S，其中S为用于提取叶绿素的叶片面积（cm²）。

植株生物量和相对生长速率测定：随机选取盆栽试验中每个处理的3棵完整植株，将其根、支持结构（茎）和叶分开，各植物器官105 ℃杀青30 min，然后65 ℃烘干至恒重，使用电子天平（精确度0.01 g）称量各器官生物量。相对生长速率（relative growth rate，RGR）=（lnW₂-lnW₁）/Δt，其中W₁表示第1次测定的总生物量（g）；W₂表示第2次测定的总生物量（g）；Δt表示2次测定的时间间隔（d）。 1.4 数据分析

应用Excel 2003和SPSS 16.0统计分析软件对测定数据进行分析。各统计数据以平均值及标准偏差表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）对黄顶菊叶片及相应土壤N、P和N∶P进行显著性检验。土壤N、P和N∶P与叶片N、P、N∶P和叶片叶绿素的关系采用Person和非线性相关分析，同时选出与叶绿素含量具有显著相关的土壤和叶片N、P因子，进一步做叶绿素含量的通径分析。 2 结果与分析 2.1 土壤N、P水平对黄顶菊叶片N∶P和地上生物量的影响

土壤N、P添加后，2P、3P和4P处理黄顶菊叶片N∶P平均值均显著低于对照（1N1P），较对照分别降低37.46%、36.30%和28.31%（图 1a）；2N处理时，叶片N∶P在2P和3P间无显著差异，而4P显著高于两者；3N处理时，叶片N∶P在2P和4P间无显著差异，而3P显著低于两者；4N处理时，叶片N∶P在3P显著高于2P，2P和4P处理间无显著差异。2N、3N和4N处理下，叶片N∶P平均值较对照（1N1P）分别降低43.47%、32.93%和25.67%，2P时，3N和4N无显著差异，但均显著高于2N；3P处理时，4N显著高于3N，3N显著高于2N；4P时，2N、3N和4N均无显著差异性。在土壤N∶P=1.67条件下，2N2P、3N3P、4N4P处理中叶片N∶P均显著低于对照（1N1P），分别较对照降低50.30%、40.38%和27.55%，其中4N4P处理中叶片N∶P显著高于3N3P处理，而3N3P处理显著高于2N2P。这表明土壤N∶P相同条件下，不同土壤N、P水平对叶片N∶P的影响存在显著差异（P<0.05）。

图 1 土壤不同N、P含量对黄顶菊叶片N∶P和地上生物量的影响（平均值±标准差） Figure 1 Effect of different N,P contents in the soil on leaf N∶P and aboveground biomass of F. bidentis （mean±SD）

图选项

2P、3P和4P处理条件下，黄顶菊植株地上生物量均显著高于对照（1N1P），其中2P和4P处理下，不同N水平对生物量的影响不显著；3P处理下，2N和3N之间无显著差异，但两者均显著低于4N（图 1b）。 2.2 土壤N、P含量与黄顶菊叶片N、P含量的关系

土壤N、P含量分别与黄顶菊叶片N、P含量具有显著相关性，叶片N、P含量均是随着土壤N、P含量的增加呈现相应的增加趋势，达到一定含量（即拐点）后，再呈现下降趋势（图 2a和图 2b）。其中土壤N元素的拐点为3.42 g·kg^-1，相应的叶片N含量为33.14 g·kg^-1；土壤P元素的拐点为1.80 g·kg^-1，相应的叶片P含量为1.58 g·kg^-1。另通过比较发现，图 2a“倒抛物线”开口（a=-1.565 8）小于图 2b“抛物线”开口（a=-0.595 7）。

图 2 土壤N、P含量与黄顶菊叶片N、P含量的二项式关系 Figure 2 Binomial relation between soil N,P contents and leaf N,P contents of F. bidentis

图选项

土壤N、P元素均与黄顶菊地上生物量具有显著相关性，地上生物量均随着土壤N、P含量的增加表现出先增加后下降趋势，其中土壤N元素的拐点为3.76 g·kg^-1，土壤P元素的拐点为1.97 g·kg^-1（图 3a和图 3b）。

图 3 土壤N、P含量与黄顶菊地上生物量的二项式关系 Figure 3 Binomial relation between soil N,P contents and aboveground biomass of F. bidentis

图选项

黄顶菊植株地上生物量随叶片N∶P呈先上升后下降趋势，叶片N∶P为22.88时，地上生物量达到最大值；叶片N∶P低于22.88时，植株地上生物量随叶片N∶P的增大而增大；而叶片N∶P超过22.88时，植株地上生物量随叶片N∶P的增大呈下降趋势（图 4）。

图 4 黄顶菊叶片N∶P与地上生物量的二项式关系 Figure 4 Binomial relation between leaf N∶P and aboveground biomass of F. bidentis

图选项

土壤N含量、叶片N含量和叶片P含量对黄顶菊叶片叶绿素含量均具有显著正相关性，其中土壤N含量与叶绿素含量达到极显著性，但它们对叶绿素含量的影响表现出不同的直接效应和间接效应，直接效应从大到小依次为土壤N含量＞叶片P含量＞叶片N含量，间接效应从大到小依次为叶片N含量＞叶片P含量＞土壤N含量。叶片P含量通过叶片N含量对叶片叶绿素含量的间接影响显著大于其直接影响（表 2）。

表 2 黄顶菊叶片叶绿素含量影响因子的通径分析 Table 2 The path analysis between each influencing factor and leaf chlorophyll content of F. bidentis

表选项

植物器官N∶P 是生态化学计量学研究的一个重要指标，在很大程度上对生态系统的结构、功能及稳定性等具有较好的生态指示作用^{[21, 22]}。土壤N∶P则对植物器官N∶P有着重要的影响。对于同一个物种来说，在相同的生境下，植物器官中的N∶P可反映植物的营养和生长状况。不同生境、不同植物叶片中N∶P则存在较大差异^{[23, 24]}。本研究中，土壤N、P养分含量对植物叶片N、P元素组成及含量有着直接的影响，土壤N∶P=1.67条件时，2N2P、3N3P、4N4P处理中叶片N∶P均显著低于对照（1N1P），分别较对照降低50.30%、40.38%和27.55%，这表明土壤N∶P相同条件下，随着土壤N、P养分含量的同步增大，黄顶菊叶片N∶P呈下降趋势，这说明在土壤N、P供应充足的条件下，植物叶片N∶P可能会保持在一个稳定的范围内^{[25, 26]}。土壤N、P添加处理后，叶片N∶P较对照（1N1P）显著下降，其中N处理对叶片N∶P的影响要高于P处理，因此相较于土壤P元素，N元素对叶片N∶P的影响较大，表现出N元素限制。王雪等^[27]的研究中也证明，仅从叶片养分指标看，N添加对植物叶片N、P 含量的影响显著高于P添加的作用。

根据叶片N∶P判断植物受养分元素限制性情况已有很多报道，但由于研究区域及植物种类的差异，叶片N∶P的临界值也会发生相应的变化^[28]，因此在使用叶片N∶P判断植物生长限制性元素时要经过科学的试验论证，尤其对一些新物种，例如外来入侵植物。本研究中，黄顶菊叶片的N、P含量最高值分别为33.14 g·kg^-1和1.58 g·kg^-1。黄顶菊生长拐点时叶片N含量在32.96～33.14 g·kg^-1，叶片P含量在1.56～1.58 g·kg^-1，因此叶片N∶P在20.86～21.24之间时，即叶片N∶P低于20.86表现出N元素限制，高于21.24表现出P元素限制，处于两者之间为N、P元素均不受限制。这也能够解释本研究中，N元素对叶片N∶P的影响较大的原因。通过野外取样试验研究中发现黄顶菊叶片N∶P在11.33（水边）表现出N素限制，在27.02（农田）则表现出P素限制^[29]，符合该模型预测。

生长速率假说认为在个体水平上，植物的生长速率随叶片N∶P比的降低而增加，随着植株生物量的增大，各器官N含量、P含量和最大生长速率均出现下降，但P含量的下降要快于N含量的下降。因此，叶片N∶P或许可以用来预测植物的生长速率^[30]。本研究中，土壤N、P添加后，黄顶菊叶片N∶P较对照均有显著降低，而地上生物量较对照均有显著增加，当叶片N∶P大于21.24时，高的叶片N∶P对应的是低的植株生物量，即低的植株生长速率，该预测符合生长速率假说；而当叶片N∶P小于21.24时，高的叶片N∶P对应的是高的植株生物量，即高的植株生长速率，该预测不符合生长速率假说。

土壤养分的供应状况对植物器官的组成结构有着强烈的影响，而结构又是植物器官功能得以发挥的基础，因此通过研究土壤和叶片N、P化学计量特征与叶片叶绿素含量的关系，能够深入了解土壤N、P养分状况对叶片光合功能影响的内在机制^[18]。N是叶绿素的组成元素，与植物光合作用能力有着密切关系。土壤N含量和叶片N、P含量对黄顶菊叶片叶绿素含量的影响表现出不同的直接效应和间接效应，其中直接效应最大的为土壤N含量，间接效应最大的为叶片N含量。王满莲等^[17]研究发现随着N含量的增加，紫茎泽兰（Ageratina adenophora）和飞机草（Chromolaena odorata） 2种入侵植物叶绿素含量均呈现上升趋势。万宏伟等^[31]相关分析的结果也表明，羊草（Leymus chinensis）、西伯利亚羽茅（Achnatherum sibiricum）、大针茅（Stipa grandis）、冰草（Agropyron cristatum）、糙隐子草（Cleistogenes squarr osa）和黄囊苔草（Carex korshinskyi） 6种植物单位质量叶片的叶绿素含量与叶片含氮量均呈显著的线性正相关关系。随着氮素添加，叶片的含氮量和叶绿素含量增加，从而导致植物净光合速率的提高，说明高氮水平有利于植物光合能力的提高和对碳素的同化，增强入侵能力。 4 结论

随着土壤N、P添加量的增加，叶片N∶P比显著下降，地上生物量较对照均显著增加，且高N素比例对叶片N∶P影响最大。黄顶菊叶片N∶P＜20.86为N限制，叶片N∶P＞21.24为P限制。

综合以上分析，N、P协同调控影响黄顶菊叶片计量特征，而其中N有可能在黄顶菊的成功入侵过程中起着重要作用。基于此，我们可以通过氮磷添加人为控制土壤中N∶P，特别是降低土壤中氮肥水平，以便创造不利于黄顶菊生长的土壤环境，实现对其有效防控。