土壤酶的主要成分是蛋白质，是一种由生物细胞 产生的生物催化剂。土壤中的各种生化反应都是在相 应的酶参与下完成的，土壤中的酶活性决定了土壤中 进行的各种生物化学过程的强度和方向，酶的活性是 土壤的本质属性之一^[1]。土壤酶活性受重金属元素的 污染的影响较为显著，其强弱与重金属的污染程度存 在着某种相关性，而土壤重金属污染中的Cd 污染具 有移动性强、生物毒性大等特点，容易通过食物链最 终进入人及其他生物体内，对人及其他生物的健康产生巨大的危害，因而土壤的Cd 污染问题受到全社会 的普遍关注。由于生物质炭的多孔及比表面积较高的 物理性质，其在Cd 污染土壤修复领域展示出极大的 应用潜力^[2]，并且大量的实验研究已表明生物质炭输 入可有效降低土壤重金属有效态含量。Novak 等^[3]研 究发现向酸性土壤施入2%的生物炭，可有效降低土 壤中重金属的含量，并认为是生物质炭导致土壤pH 值升高所致；Neill 等^[4]研究表明，生物质炭的施入可 以改善土壤结构，同时还可以增加土壤的基础呼吸及 呼吸速率，因而对污染土壤具有修复作用；Beesley^[5]在 土壤中施入生物质炭后，Cd 浓度下降了10 倍，植物 毒害也降低显著。但是国内对生物质炭的施用对Cd 污染土壤中各类酶活性的研究较少，且生物质炭对 Cd 污染土壤的具体作用影响机制尚不明确，本文就 该方面对经生物质炭钝化后的Cd 污染土壤酶活性 变化进行分析与研究，以期为生物质炭对Cd 污染土 壤的修复从酶活性改善的角度提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 试验设计

选取云南农业大学后山红壤作为试验供试土壤， 将CdCl₂·2.5H₂O 与去离子水配成母液，稀释成处理 浓度（5 mg·kg^-1）后与土壤反复混合均匀，同时设置 Cd空白的对照。选取秸秆生物炭按添加量（0、2.5%、 5%的质量比）进行原状土添加，即得到6 种不同处理 的土样：（1）Cd含量0 mg·kg^-1，生物质炭0%（Cd0C0）； （2）Cd 含量0 mg·kg^-1，生物质炭2.5%（Cd0C2.5）；（3） Cd 含量0 mg·kg^-1，生物质炭5%（Cd0C5）；（4）Cd 含 量5 mg·kg^-1，生物质炭0%（Cd5C0）；（5）Cd 含量5 mg·kg^-1，生物质炭2.5%（Cd5C2.5）；（6）Cd 含量5 mg· kg^-1，生物质炭5%（Cd5C5）。经处理的土壤样品分装 后置于玻璃温室中，在自然状态下进行老化处理60 d，保持土壤水分在田间水量的70%^[6]。后对以上处理 过的6 种样品分别测定土壤中的FDA 水解酶、纤维 素酶、蛋白酶、脲酶、蔗糖酶、磷酸酶及过氧化氢酶的 活性。表 1为试验用生物炭的基本性质。

表 1 生物炭的基本性状 Table 1 General characteristics of biochar

表选项

对FDA 水解酶（又名荧光素二乙酸酯酶）以无色的荧光素二乙酸为基质，采用比色法来测定其活性； 纤维素酶采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定纤维素 酶解所产生的还原糖量来表示其活性；蛋白酶酶活的 测定采用茚三酮比色法，以24 h后1 g土壤中的氨基 氮的毫克数表示；脲酶的酶活采用苯酚钠-次氯酸钠 比色法，以尿素为基质，测定其活性；蔗糖酶酶活采用 二硝基水杨酸比色法测定，以24 h后1 g土壤中的葡 萄糖毫克数来表示；磷酸酶酶活的测定采用磷酸苯二 钠比色法来测定，以磷酸苯二钠为基质，在磷酸酶的 作用下，水解基质所生成的苯酚的量来表示；过氧化 氢酶酶活采用紫外分光光度法测定，以每20 min 内 每克土壤分解的过氧化氢的毫克数来表示^{[7, 8, 9, 10, 11]}。为消 除土壤中原有物质对实验结果造成的误差，以上每种 土样的酶活测定均需要设置无基质对照，整个实验需 做无土对照，为使实验结果精准可靠，每种土样的酶 活测定也需做平行对照。 1.3 酶活性综合值的计算

根据前人研究结果及各种酶的具体作用及性质， 将所选取的土壤酶分为两大类，第一类为对土壤碳循 环变化响应较为明显的酶类，包括：FDA 水解酶、纤维 素酶、蛋白酶；第二类为对Cd 活性变化响应较为敏感 的酶类，这类酶也被称之为土壤氧化还原酶，其中包 括脲酶、蔗糖酶、磷酸酶及过氧化氢酶^{[12, 13, 14]}。对这两大 类型的酶活性分别求取几何平均数，作为衡量土壤中 碳循环相关酶及氧化还原酶活性的指标，其中土壤碳 循环酶的公式为^[15]：GMea₁=；土壤氧 化还原酶活性公式为：GMea₂=；最 后，对不同处理下的土样的各种酶活性求几何平均 数，作为衡量土壤质量的综合酶活性指标，公式为： GMea=。式中，FDA 代表FDA水解酶活性；Cel代表纤维素酶活性；Pro代 表蛋白酶活性；Ure代表脲酶活性；Inv代表蔗糖酶的 活性；Pho代表磷酸酶的活性；Cat代表过氧化氢酶的 活性。 1.4 数据处理

文中分析数据采用Excel（2007）统计软件及SPSS 软件进行分析处理。 2 结果与分析 2.1 外加镉处理下生物质炭输入对土壤碳循环酶活性的影响

经测定，不同生物质炭量的输入对Cd 污染土壤碳循环相关的酶活性产生了显著影响。由表 2可以看 出，当试验土壤不加外源Cd 时，不同生物炭量的施 入对FDA 水解酶活性有着显著的影响，并且当生物 质炭的含量为2.5%时，该酶活降至最低值，为0.016 8 μg·g^-1，比不添加生物质炭时的0.236 9 μg·g^-1降低了 92.91%，当生物质炭的施入量为5%时，FDA 水解酶 的活性有所提高，为0.195 9 μg·g^-1；而当Cd 的加入 量为5 μg·kg^-1时，不同量的生物质炭的施入对FDA 水解酶活性的影响趋于平稳，酶活性之间的差异不明 显，最低值为不添加生物质炭，为0.109 6 μg·g^-1，最高 值为生物质炭施入量2.5%时的0.157 μg·g^-1，变化量 为29.94%。

纤维素酶的酶活在不同量的生物炭作用下大体 变化不是很显著。当不加Cd 时，纤维素酶的酶活性 随着生物质炭量的增加呈现出较为显著的递增关系， 从不添加生物质炭的0.102 3 mg·g^-1增加到生物质炭 含量2.5%时的0.114 3mg·g^-1再到生物质炭含量为5% 时的0.136 4 mg·g^-1，分别增加了10.50%和16.42%；而 当Cd的加入量为5 mg·kg^-1时，这种递增关系打乱，当 生物质炭的含量为2.5%时，纤维素酶的酶活性最高 为0.133 5 mg·g^-1，比生物质炭含量为0 和5%时的 0.117 8 mg·g^-1 和0.118 0 mg·g^-1分别高出11.76%和 11.61%，由此可见当生物质炭的施入量为2.5%时，纤 维素酶在不同Cd污染程度下的活性变化相对显著。

蛋白酶的酶活性随着不同生物质炭量的加入变 化相当明显，由表 2 的数值可以明显看出，当土壤中 不加Cd 时，蛋白酶的活性从不加生物质炭的0.492 8 mg·g^-1下降到生物质炭含量为2.5%时的0.181 5 mg· g^-1，下降63.17%而后趋于平稳；而当Cd 的含量为5 mg·kg^-1时，土壤蛋白酶的活性随着生物质炭量的增 加也是先显著降低然后趋于平稳，只是酶活的整体活 性水平有所提高，最高为不添加生物质炭时的0.999 2 mg·g^-1，当土壤中生物质炭的含量为2.5%时，蛋白酶 的活性下降为0.199 0 mg·g^-1，下降80.08%后趋于稳 定；当不加生物质炭时，蛋白酶的活性由不受Cd 污 染时的0.492 8 mg·g^-1上升到Cd 含量为5 mg·kg^-1 的 0.999 mg·g^-1，上升50.65%。由此可见生物质炭含量 2.5%时，蛋白酶的变化梯度相对较为明显。

表 2 不同处理下土壤碳循环酶的活性分布 Table 2 Soil carbon cycle enzymes activity distribution under different treatments

表选项

测定表明，受Cd 污染土壤的脲酶活性在加入生 物炭后活性整体降低。由表 3 的数值易于看出当土壤 中不加Cd 时，随着生物质炭量的增加，脲酶的酶活性 改变不甚明显，而当Cd 含量为5 mg·kg^-1 时，随着生 物质炭量的增加，该酶的活性亦是相对平稳，只是Cd 含量为5 mg·kg^-1 时，脲酶活性的平均水平为0.084 9 mg·g^-1，比不加Cd 时的0.116 6 mg·g^-1低23.33%。可 见土壤受Cd 污染后对土壤脲酶活性具有抑制作用。

表 3 不同处理下土壤氧化还原酶的活性值 Table 3 Soil REDOX enzymes activity distribution under different treatments

表选项

随着土壤受Cd 污染的不同程度及生物质炭量 的施入，蔗糖酶活性变化显著。当土壤中Cd 的含量 为5 mg·kg^-1时及土壤中不含Cd 时，随着生物质炭的 施入，蔗糖酶活性均呈现先高后低的趋势，最高均为 生物质炭的含量为2.5%时，土壤中不含Cd 时，蔗糖 酶活为0.075 2 mg·mL^-1 ，土壤中Cd 的含量为5 mg· kg^-1 时，蔗糖酶活为0.065 6 mg·mL^-1 ，计算可得，这2类的酶活相差0.009 6 mg·mL^-1 ，下降12.76%。当不加 生物质炭时，蔗糖酶的活性变化量相对较小，为 6.97%，当生物质炭的施入量为5%时，蔗糖酶活性变 化33.33%。

磷酸酶活性对土壤Cd 污染表现出极强的相关 性，由表 3 的数据可以分析得出当土壤中不加入Cd 时，随着生物质炭的施入，磷酸酶活性先高后低，此 时，该酶活性的平均值为0.063 1 μg·g^-1，而当Cd 含 量为5 mg·kg^-1时，土壤磷酸酶活性急剧下降，平均值 只有0.013 0 μg·g^-1，与不受Cd 污染的土壤相比，下 降了79.40%，变化梯度显著，可见磷酸酶对Cd 污染 土壤的响应异常敏感。而当不加生物质炭时，土壤中 不加Cd 时磷酸酶的活性比Cd 含量为5 μg·g^-1时下 降了68.75%，而当生物质炭的施入量为2.5%、5%时， 不同Cd 污染土壤磷酸酶的活性变化率分别为 79.73%和85.07%，变化幅度显著。

当土壤中不受Cd 污染时，随着生物质炭的施入 量的增加，过氧化氢酶的活性先是略微下降后上升； 当Cd的含量为5 mg·kg^-1时，随着生物质炭的施入量 的增加，该酶酶活先升后降，最高为生物质炭的含量 为2.5%时的3.317 mL·g^-1，比不加生物质炭时的 2.436 8 mL·g^-1 及施加5%的生物质炭量的2.623 8 mL·g^-1分布高出26.53%和20.89%。 2.3 外加镉处理下生物炭输入对土壤综合酶活性的影响

2.3.1 不同处理下土壤碳循环酶的综合酶活性比较

对不同处理下的土壤碳循环相关的酶活性求几 何平均数（Geometric mean），作为衡量土壤碳循环酶 的综合指标，其计算结果如图 1 所示。从图 1 中可看 出不同处理下的土壤碳循环相关酶活性变化，在土壤 不受Cd 污染的情况下，土壤碳循环的酶活综合指数 值最高为生物质炭用量为2.5%时，其值为0.235，而当生物质炭的施入量为5%时，酶活性下降显著，为 0.707，下降了69.92%；当土壤Cd 含量为5 mg·kg^-1 时，土壤碳循环酶活性综合指数值最高亦为生物质炭 的施入量为2.5%时的0.174，比不加生物质炭时的 0.161 及生物质炭用量为5%时的0.140 分别高出 7.4%、19.5%。

图 1 不同处理下土壤碳循环酶的综合活性分布 Figure 1 Soil carbon cycle enzymes activity distribution under different treatments

图选项

对不同处理下的土壤氧化还原酶活性求几何平 均数，作为衡量土壤中氧化还原酶酶活性综合值的指 标，其计算结果如图 2所示。从图 2 可看出在土壤不 含Cd 时及Cd 的加入量为5 mg·kg^-1 时，土壤氧化还 原酶的综合活性均是先升后降。当不加Cd 时，生物 质炭含量为2.5%时，土壤氧化还原酶的活性最高，其 值为0.202，比不加生物质炭时的0.157 及生物质炭 用量为5%时的0.194 分别高出22.52%、3.8%；当土 壤Cd 含量为5 mg·kg^-1时，氧化还原酶综合活性指数 最高亦为生物质炭的施入量为2.5%时，其值为0.131， 比不加生物质炭时的0.107 及生物质炭用量为5%时 的0.093 分别高出18.50%、28.90%。

图 2 不同处理下土壤氧化还原酶的综合活性分布 Figure 2 Soil REDOX enzymes activity distribution under different treatments

图选项

对不同处理下的土壤中各种酶活性求几何平均 数，作为衡量土壤质量的综合酶活性指标，其计算结 果如图 3 所示。无论土壤受Cd 污染与否，土壤各种 酶的综合活性指数最高值均为生物质炭的含量为 2.5%。当土壤不加Cd时，生物质炭含量2.5%时的综 合酶活性指数为0.215，比不加生物质炭时的0.184 及生物质炭用量为5%时的0.090 分别高出14.42% 及58.14%；当土壤Cd 添加量为5 mg·kg^-1时，生物质 炭含量2.5%时的综合酶活性指数为0.108，比不加生 物质炭时的0.091 及生物质炭用量为5%时的0.077 分别高出16.26%及28.57%。

图 3 不同处理下两类土壤酶的综合活性分布 Figure 3 Integrated active distribution of two classes of soil enzymes under different treatments

图选项

重金属对土壤酶活性的影响受多种因素的制约， 比较常见的有土壤类型、重金属种类、重金属的浓度 以及土壤酶的种类，由以上的数据分析结果可以得 知，当土壤受Cd 的污染程度一致时，不同类别的酶 随着生物质炭的不同量的添加，其活性有着不同的变 化趋势。这可能是由于生物质炭的强吸附作用，使得 生物质炭对土壤酶活性的影响较为复杂，一方面，生 物质炭对反应底物的吸附有助于酶促反应的进行而 提高土壤团聚体的酶活性，另一方面，生物质炭对酶 分子的吸附对酶促反应结合位点形成保护，而阻止酶 促反应的进行^[16]，这就使生物质炭对不同的酶活性所 产生的影响不尽相同。Beesley^[5]通过向高Cd、高Cu 含 量的土壤中添加生物质炭60 d后，土壤毛细管水中 这2种重金属的浓度显著降低，从而使其对土壤酶的 抑制作用也有所下降。本文研究表明，外源有机物料 中生物质炭向土壤中的施入对Cd 污染土壤的酶活 产生一定影响，其中对其响应最为敏感的酶为FDA 水解酶。当生物质炭施入量为2.5%时，FDA水解酶酶 活从不加Cd 的0.016 8 μg·g^-1上升到0.157 μg·g^-1，上 升89.17%，这大致是因为土壤中的荧光素二乙酸酯 （FDA）通常能被许多酶如酯酶、蛋白酶、脂肪酶等所 水解而致^[17]。

土壤中Cd元素的加入对土壤酶活存在着显著的 影响，其中以脲酶、磷酸酶等氧化还原酶类的反应最 为敏感，蔗糖酶次之，且其影响以抑制作用为主。对其 可能的抑制机理分析有：重金属直接作用于酶分子， 使酶的构象发生改变，从而影响酶的活性；重金属抑 制土壤微生物的生长繁殖，从而使微生物体内酶的合 成和分泌量减少，进而影响酶的活性；重金属影响到 作物的代谢活力，使根分泌、释放酶的能力受影响^[17]。 脲酶是一种对尿素专性较强的酶，它能酶促尿素水解 成氨、二氧化碳和水，其活性反应土壤无机氮的供应 能力；磷酸酶是一种水解酶，能加速有机磷的脱磷速 度，提高土壤磷素有效性，其活性是评价土壤磷素生 物转化方向与强度的指标^{[18, 19]}。从本文的实验结果可 以证明，通常采用脲酶的活性变化作为评价土壤是否 受Cd 污染是合理的，但是，在土壤中Cd 的含量为5 mg·kg^-1时，磷酸酶的变化幅度较脲酶更为明显。

由于生物质炭独特的理化性质使得其向土壤中 的施入可以加速土壤中生物化学反应的活跃程度、土 壤微生物的活性以及养分物质的循环状况^[20]，进而改 变土壤酶的活性。Steiner 等^[21]发现通常土壤中生物质 炭的施入量为5%~10%时，土壤呼吸及土壤微生物量 与生物质炭量呈线性关系，而本文通过实验证明，当 生物质炭的施入量为土壤质量比的2.5%时，对Cd 污 染土壤各类酶综合指数的影响均较明显，这可能是正 常土壤与外加Cd处理下的土壤区别所致。牛文静等^[8] 研究表明，外源有机物料的施入显著提高了土壤中 200~2 000 μm 和<2 μm 两粒组中酶活性的综合指 数，可见土壤酶活性综合指数可以较好反映土壤生物 学性状，是指示土壤生物质量的综合评价指标^[10]。本 实验研究证明外加Cd 处理下，2.5%的生物质炭施入 量提高了土壤酶活性综合指数，比其他2 种处理分别 提高了16.26%、28.57%。可见该用量的生物质炭对Cd 污染土壤酶活性的恢复具有更加深入的研究意义。 4 结论

（1）生物质炭对Cd 污染土壤的酶活会产生一定 的恢复效应，其中对其响应较为敏感的有FDA 水解 酶及蛋白酶；土壤中外源镉的添加对土壤酶活存在着 显著抑制作用，其中以脲酶、磷酸酶等氧化还原酶类 的反应最为敏感。

（2）土壤中Cd 的含量为5 mg·kg^-1 时，在外源生 物质炭输入下，磷酸酶的变化幅度比其他氧化还原酶 均要高。证明在此情况下磷酸酶对土壤重金属的污染 的响应比普遍认为的脲酶更加敏感。

（3）本实验条件下土壤中的碳循环酶、氧化还原 酶及土壤质量的综合酶活性指标最高均为生物质炭 用量为2.5%，这表明此用量的生物质炭施入可对镉 污染土壤的酶活性起到最好的恢复作用。