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  农业资源与环境学报  2014, Vol. 31 Issue (5): 470-475

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杜东霞, 尹红梅, 张德元, 刘标, 许隽, 王震, 贺月林
DU Dong-xia, YIN Hong-mei, ZHANG De-yuan, LIU Biao, XU Jun, WANG Zhen, HE Yue-lin
发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR反应条件的建立与优化
Establishment and Optimization of Microbial 16S rDNA PCR Reaction Conditions in Fermentation Bed Padding Material
农业资源与环境学报, 2014, 31(5): 470-475
Journal of Agricultural Resources and Environment, 2014, 31(6): 513-520
http://dx.doi.org/10.13254/j.jare.2014.0102

文章历史

收稿日期:2014-04-24
发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR反应条件的建立与优化
杜东霞, 尹红梅, 张德元, 刘标, 许隽, 王震, 贺月林     
湖南省微生物研究院,湖南 长沙 410009
摘要:为探讨发酵床垫料中微生物16S rDNA基因扩增实验中诸多因素对实验结果的影响,采用单因素法对16S rDNA基因扩增时PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg2+、dNTP、引物、Taq酶、模板DNA)5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度、循环次数。结果表明:25μL的最佳反应体系为:10×PCR buffer 2.5μL、MgCl22.0 mmol·L-1、dNTP 0.2 mmol·L-1、引物0.2μmol·L-1、Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 50 ng;最佳反应程序为:在94℃下进行4 min预变性;随后循环扩增25个循环(包括94℃变性45 s,53.7℃退火30 s,72℃延伸90 s);最后在72℃下延伸10 min。
关键词发酵床垫料     16SrDNA     单因素法     退火温度    
Establishment and Optimization of Microbial 16S rDNA PCR Reaction Conditions in Fermentation Bed Padding Material
DU Dong-xia, YIN Hong-mei, ZHANG De-yuan, LIU Biao, XU Jun, WANG Zhen, HE Yue-lin     
Hunan Academy of Microbiology,Changsha 410009,China
Abstract:In order to study the influence of several potential factors on 16S rDNA PCR reaction conditions in fermentation bed padding mate- rial, five factors(Mg 2+, dNTP, primer, Taq DNA polymerase and DNA template)were optimized by single factor experiment at 5 concentration levels. Annealing temperatures and amplification cycle numbers were also optimized. The results showed that the optimum 25 μL reaction system comprised 10×PCR buffer 25 μL, MgCl 2 2.0 mmol· L -1, dNTP 0.2 mmol· L -1, primer 0.2 μmol· L -1, Taq DNA polymerase 0.5 U and DNA template 50 ng; and the optimum PCR procedure was as an initial pre-denaturing at 94 ℃ for 4 min, which preceded 25 cycles of dena-turing at 94 ℃ for 45 s, annealing at 53.7 ℃ for 30 s, and extension at 72 ℃ for 90 s, with a final extension at 72 ℃ for 10 min.
Key words: fermentation bed padding material     16S rDNA     single factor experiment     annealing temperature    

随着规模化养猪产业的迅速发展,养殖场造成的 环境污染问题显得日℃突出。而发酵床养殖技术是依 据自然生态理念和微生态原理,集畜禽粪尿无害化处 理与科学饲养于一体的新型环保养猪技术[1]。该养殖 技术是以猪舍内铺设谷壳、米糠、锯末等原料组成的 基质垫料作为培养基,人为接种一些环境℃生菌,猪 饲养过程中所排放的粪尿在猪舍内经微生物原地发 酵迅速降解、消化,从而达到零污染、零排放,从源头 实现环保、无公害的养殖目的[2]

发酵床养殖技术的精髓是微生物的发酵和代谢 作用,起主要作用的微生物群落结构十分复杂,除了 发酵床垫料中的土著微生物外,还包含人为添加的一 些功能微生物菌群,在饲养环境下,微生物在相互作 用过程中,其群落结构和数量此消彼长,处于不断变 化过程中,最终会产生一些优势菌群,主导着畜禽粪 便的无害化过程[1, 3]。因此,有必要弄清楚成分复杂的 发酵床垫料中微生物的种类、数量、亲缘关系以及群 落的演替规律,有助于开发出新型、高效、安全、稳定 的微生物菌剂,促进发酵床养猪技术的进一步发展。 然而,近几年来,发酵床垫料中的微生物群落动态及 分子生态学的研究显得十分的薄弱,一方面是由于许 多功能微生物无法在实验室培养,传统的微生物纯培养无法反映发酵床垫料中微生物的丰度;另一方面用 分离微生物的方法研究微生物群落动态变化规律工 作十分繁重,而且对了解微生物实际群落变化比较 困难[2]

近年来,随着现代生物技术和微生物分子生物学 的迅速发展,基于DNA分析的分子生态技术为解决该 难题提供了强有力的工具。通过菌群的DNA分析可以 比较全面地了解发酵床垫料中微生物群落的结构变 化,极大地促进发酵床垫料中微生物多样性的研究。 它既可以绕开传统分离方法复杂和繁琐的操作,又可 以鉴定纯培养方法难以鉴定的菌种[4, 5]。但该方法的应 用必须以获得能真实反映原环境样品中微生物实际 组成状况的总DNA 及高质量的PCR 产物为基础,鉴 于此,本文对发酵床垫料中微生物总DNA 的提取方 法进行了探索,同时建立与优化了微生物16S rDNA PCR 反应条件,为揭示发酵床垫料中微生物群落的动 态变化规律及研制高效专一的发酵床复合菌剂奠定 理论基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 发酵床垫料

来源于唐人神养殖场,在发酵床垫料30 cm 处 “Z”字形5 点取样,混合均匀后作为实验样本,塑料袋 密封低温保存。 1.1.2 主要试剂和设备

土壤总DNA提取试剂盒(UltraCleanSoilDNAIso lation Kit),购于美国MOBIO 公司;PCR 仪(Mastercy cler pro)购于Eppendorf 公司;Cary50 紫外可见分光 光度计购自美国VARIAN 公司;5424R 小型台式高速 冷冻离心机购自德国Eppendorf 公司;DYY-6C 型电 泳仪购自北京六一仪器厂;Bio-Rad Gel Doc 2000 型 凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。 1.2 实验方法 1.2.1 发酵床垫料中微生物总DNA 提取

参照文献[6]的方法并进行了适当修改。 1.2.1.1 发酵床垫料样品预处理

新鲜垫料经液氮研磨之后,称取5 g于30 mL 离 心管中,用TENP缓冲液洗涤,直到上清液清澈透明, 离心的沉淀用于DNA提取。 1.2.1.2 发酵床垫料中微生物总DNA 提取

采用以下2 种方法对制备的发酵床垫料样品进 行微生物总DNA 的提取。

(1)SDS-CTAB 结合法:①称取2 g 沉淀置于30 mL洁净离心管中,在沉淀中加入15 mL SDS 裂解液, 200 μL 蛋白酶K 和0.8 mL 异硫氰酸胍洗液,轻轻颠 转混匀,65 ℃温育1 h;②6 000 r·min-1离心10 min,转 移上清液至30 mL 洁净离心管;③加入0.2 倍体积的 醋酸钠溶液和1.7 倍体积的10% PEG8000 溶液,-20 ℃下静置15 min;④10 000 r·min-1,4 ℃,离心10 min, 留沉淀;⑤往沉淀中加入15 mL CTAB 裂解液,65 ℃ 温育15 min;⑥加入等体积氯仿颐异戊醇(24:1),轻轻 混匀,10 000 r·min-1离心10 min;⑦将上清液转移到 新的30 mL 离心管中,加入2 倍体积的无水乙醇,置 于4 ℃过夜;⑧12 000 r·min-1,4 ℃,离心10 min,弃上 清液,留沉淀。用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀,转移到 1.5 mL离心管中。14 000 r·min-1,4 ℃,离心3 min,弃 上清液,留沉淀。再重复洗涤1 次,超净台吹干,之后 加入300 μL 无菌水溶解DNA,-20 ℃保存备用。

(2)土壤总DNA 提取试剂盒法:该实验步骤严格 参照说明书进行操作。 1.2.2 DNA 浓度和纯度的测定方法

用紫外分光光度法分别测定不同方法提取的 DNA 溶液在不同波长处的吸光度(OD260、OD230、 OD280),根据公式:[dsDNA] = 50×OD260×稀释倍数,计 算DNA的浓度(单位为μg·mL-1),分别用OD260/OD230、 OD260/OD280估算所提取DNA 的纯度。 1.2.3 发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR 反应体系的建立

引物:27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')扩增细菌 16S rDNA;

PCR 扩增体系:10×PCR buffer 2.5 μL,dNTPs 2 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,DNA 模板稀释 液1 μL,Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL,其余用无 菌水补齐至25 μL;

PCR 反应条件:94 ℃预变性4 min,(94 ℃变性45 s,53℃退火30 s,72 ℃延伸90 s)30个循环,最后72 ℃ 延伸10 min。 1.2.4 发酵床垫料中微生物16S rDNA 的PCR 反应条件优化

退火温度的选择:对扩增程序中最为关键的退火 温度进行优化,分别设置为:48.3、50.0、51.8、53.7、 55.5 ℃。

循环次数的选择:在确定最佳退火温度后,选择 不同循环次数进行扩增。循环次数分别为20、25、30、35、40、45 个。

引物浓度的选择:引物浓度梯度设置为0.2、0.4、 0.6、0.8、1.0 μmol·L-1

dNTPs 浓度的选择:dNTPs 浓度梯度设置为0.1、 0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1

不同Taq DNA 聚合酶用量的选择:Taq DNA 聚 合酶浓度梯度设置为0.5、0.75、1.0、1.5、2 U。

模板DNA 浓度的选择:模板DNA 浓度梯度设置 为20、30、40、50、60、70 ng。

Mg2+浓度的选择:Mg2+浓度梯度设置为1、1.5、2、 2.5、3.0 mmol·L-1

PCR 扩增产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。 2 结果与分析 2.1 发酵床垫料中微生物总DNA 的纯度和浓度检测结果

将不同方法处理提取的垫料微生物总DNA 通过 紫外分光光度计测定的数据见表 1。DNA 纯度是衡量 垫料微生物总DNA 提取的重要指标,一般用A260/A280 和A260/A230 的比值分别检测提取DNA 样品中蛋白质 和腐植酸杂质的污染程度[7, 8]。A260/A230比值越大,DNA 越纯;反之A260/A230比值越低,腐植酸污染越严重。一 般来说,当A260/A280 比值大于1.7 时,DNA 较纯,否则 有蛋白质污染[2, 9]

表 1 不同方法提取的垫料DNA的纯度和浓度 Table 1 Purification and concentration of extracted DNA from gaskets by different methods
2.2 最佳退火温度

利用梯度PCR 对最佳退火温度进行筛选,由图 1 可知,随着退火温度的逐渐升高,所对应泳道的目的 条带逐渐明亮、清晰,当退火温度升高至53.7 ℃时条 带达到最亮。但是若温度继续升高至55.5 ℃时几乎 没有目的条带出现。综合考虑,最佳退火温度设置在 53.7 ℃较为合适。

图 1 不同退火温度对PCR效果的影响 Figure 1 Effectof differentannealing temperatureson PCRproducts
2.3 最佳循环次数

选择合适的循环次数对扩增结果的影响非常大。 理论上,循环次数越多,扩增产率越高。保持其他程序 设置不变,在退火温度为53.7 ℃时进行20、25、30、 35、40、45 次循环。由图 2 可知,由20 至25 个循环,扩增产物的量逐渐升高,但循环次数过高则扩增效果 并不理想。当循环次数达到30个循环时,扩增的量开 始降低,当再逐渐升高时,几乎看不到单一条带。由此 可知,在该退火温度下的最佳循环次数为25个。

图 2 不同循环次数对PCR效果的影响 Figure 2 Effect of different cycle times on PCR products
2.4 最佳引物浓度

在最佳退火温度和最佳循环次数下,对最佳引物 浓度进行了筛选,具体引物浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0 μmol·L-1;由图 3可知,在PCR 反应过程中并不是 引物的浓度越高越好,随着引物浓度的增加,PCR 产 物的扩增量并没有增加,当达到0.8 μmol·L-1 时,扩 增量反而降低。所以在PCR 反应体系中,引物浓度过 高不仅造成试剂的浪费,而且会干扰PCR过程。由此 可知,最佳引物浓度为0.2 μmol·L-1

图 3 不同引物浓度对PCR 效果的影响 Figure 3 Effect of diferrent primer concentration on PCR products
2.5 最佳dNTP 浓度

已有研究表明,在PCR 扩增中,过高的dNTP 浓 度可能导致碱基错配而出现非特异性扩增,过低浓度又可能会因过早地消耗而使产物单链化或产物量不 足[10]。由图 4 可知,当dNTP 浓度为0.1~0.3 mmol·L-1 时,扩增出的谱带较为一致,其中以0.2 mmol·L-1 浓 度扩增量最多;当dNTP 的浓度等于或高于0.4 mmol·L-1时,看不出单一的条带。由此可知,该反应体 系中dNTP的最佳用量为0.2 mmol·L-1

图 4 不同dNTPs浓度对PCR效果的影响 Figure 4 Effect of diferrent dNTPs concentration on PCR products
2.6 最佳DNA 模板浓度

一般来说,DNA 模板的适宜用量有一个较大的 范围,在此范围内随着DNA 量的增加条带更加清晰, 但DNA 模板浓度并不是越高越好,DNA 浓度过高反 而增加退火时引物结合的难度,造成PCR 扩增产量 降低。由图 5可知,随着DNA 模板浓度由20~50 ng的 升高,PCR 扩增量也逐渐增多,但当DNA 模板浓度大 于50 ng 时,PCR 扩增条带开始变弱,因此,本反应体 系的最佳DNA 模板浓度为50 ng。

图 5 不同DNA 模板浓度对PCR 效果的影响 Figure 5 Effect of diferrent DNA template concentration on PCR products
2.7 最佳Taq DNA 聚合酶浓度

Taq DNA 聚合酶的种类及其浓度是影响PCR 扩 增的关键因素。过高浓度的Taq 酶不仅会造成不必要 的浪费,且使得非特异性扩增产物的几率增大,过低 的浓度则会降低合成效率。由图 6 可知,0.5~2.0 U TaqDNA 聚合酶的5 个泳道均有扩增产物,而且没有 太大的差异,因此,结合经济角度和实际观测结果,可 确定0.5 U为本实验中Taq DNA 聚合酶的最佳浓度。

图 6 不同Taq DNA 聚合酶浓度对PCR效果的影响 Figure 6 Effect of diferrent Taq DNA polymerase concentration on PCR products
2.8 最佳Mg2+浓度

影响PCR 反应结果的一个重要因素是MgCl2浓 度,它不仅影响引物与模板的结合效率和引物二聚 体的形成,还影响Taq DNA 聚合酶的活性,Mg2+浓 度对PCR 扩增的特异性和效率影响很大,通常认为 Mg2+的适宜浓度范围在1.5~2.5 mmol·L-1之间[4, 11]。由 图 7 可知,Mg2+浓度在1.0~3.0 mmol·L-1 范围内,除了1 mmol·L-1 Mg2+浓度没有扩增条带之外,其他浓度条 件下均有扩增产物,综合考虑,该反应条件下的最佳 Mg2+浓度为2 mmol·L-1

图 7 不同Mg2+浓度对PCR效果的影响 Figure 7 Effect of diferrent Mg2+ concentration on PCR products
2.9 发酵床垫料中微生物16S rDNA 的最佳反应体系和反应程序

综上所述,以发酵床垫料中微生物总DNA 为模 板,扩增16S rDNA 反应体系中5 个因素的最佳浓度 为:总体积为25μL的反应体系包括MgCl2、dNTP和引 物的浓度分别为2.0、0.2 mmol·L-1和0.2 μmol·L-1,以 及0.5 UTaq DNA聚合酶和50ng DNA模板。最适反应 程序为先在94 ℃进行4 min 预变性;随后以94 ℃变 性45 s,53.7 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s为单个循环步 骤,循环扩增25 次;最后在72 ℃下延伸扩增10 min。 最佳反应体系和反应程序的PCR 效果见图 8

图 8 最佳反应体系和反应程序的PCR效果 Figure 8 PCR result of the optimum PCR reaction system and procedure
3 讨论

基于传统微生物分析方法的制约,Olsen 等[12]在 1986 年提出运用核糖体RNA 技术来研究微生物多 样性,从此进入了以分子生物学、生物标记等技术为 基础的现代微生物分析时代。在成分复杂的发酵床垫 料中含有大量的多糖、多酚、单宁、色素以及腐植酸, 在微生物DNA提取过程中,这些物质的存在会严重 影响DNA的质量和纯度,能否有效地去除这些物质 关系到整个DNA 提取过程的成败[2]

在以微生物基因组DNA 为模板,扩增16S rDNA 的过程中,模板DNA 的质量是决定PCR 成败与否的 关键之一。若模板量太少,则引物与模板不能有效配 对,扩增效率低下;而若模板量太高,在退火过程中由 于模板密集导致引物难以找到结合位点,从而PCR 产量过低。引物是得到优质的特异性强PCR 产物的 关键。引物浓度偏高会发生错配和非特异性扩增,影 响靶序列的PCR 产量和质量,而且过多引物形成二 聚体造成资源浪费;浓度偏低会导致引物与模板结合 效率低,靶序列PCR产物量减少。Taq DNA聚合酶在 PCR 反应中起到非常关键的作用,但以适量为止,过 多添加Taq DNA 聚合酶不仅造成药品的浪费,而且 会产生非特异性扩增,导致靶序列PCR 产物产量和 质量的下降;低浓度Taq DNA 聚合酶会影响合成效 率,导致靶序列PCR 扩增产物减少。退火温度是PCR 反应过程中最关键的环节,受不同靶DNA 序列GC 含量的不同,导致它们PCR 扩增的退火温度差异较 大。通常GC 含量越高为了有效解链,需要越高的退 火温度。由于循环次数的增加会导致非特异性产物的 增加,所以确定其他反应参数之后进行优化是比较合 理的,以更好地提高靶序列PCR 产物的质量[4, 13]4 结论

为了更好地研究复杂多变的发酵床垫料中微 生物的多样性,本文对发酵床垫料中微生物总DNA 的提取方法进行了探索,同时建立与优化了微生物 16S rDNA PCR 反应条件,为揭示发酵床垫料中微生 物群落的多样性及其动态变化规律奠定了理论基础。

PCR 反应过程中各参数是相互依存的,退火时, 引物与模板DNA 结合,在Taq DNA 聚合酶和dNTP 存在下进行延伸,Mg2+是Taq 酶的激活剂。本文从 PCR 反应的稳定性和经济性因素的角度考虑,确定了 发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR 扩增的最佳反应 体系和条件,25 μL 的最佳反应体系为:10×PCR buffer 2.5 μL、MgCl2 2.0 mmol·L-1、dNTP 0.2 mmol·L-1、 引物0.2 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶0.5 U、DNA 模板 50 ng;最佳反应程序为:在94 ℃下进行4 min预变性; 随后循环扩增25 个循环(包括94 ℃变性45 s,53.7 ℃ 退火30s,72℃延伸90 s);最后在72℃下延伸10 min。

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