黄顶菊（Flaveria bidentis）是菊科、堆心菊族、黄 顶菊属一年生杂草，原产于南美洲，后来传播到非洲、 欧洲、澳大利亚和亚洲的一些国家^[1]，2001 年，我国天 津和河北的衡水市首次发现黄顶菊，但有调查推断， 其早在1996 年便已传入我国^[2]。黄顶菊对生境适应性 强，耐盐碱和干旱，生态幅广泛，具有繁殖能力强、种 子产量大、且种子小而轻、易于扩散等特点，有“生态 杀手”之称^[3]。2010 年，黄顶菊被列入环境保护部和中 国科学院发布的《中国第二批外来入侵物种名单》； 2013 年亦被列入《国家重点管理外来入侵物种名录 （第一批）》。

土壤微生物多样性是生物多样性的重要组成部 分。然而，土壤是自然环境中最为复杂的异质体系，这 就决定了土壤微域环境的多样化和土壤微生物的高 度多样性^[4]。近年来，关于黄顶菊对入侵地土壤生态系 统的研究大多集中在土壤养分含量^{[5, 6]}、细菌群落多样 性^{[7, 8]}和真菌群落多样性^[9]等方面，有关黄顶菊入侵对 土壤微生物群落功能多样性的研究却尚无报道。外来 入侵植物是导致入侵地土壤微生物群落组成和功能 发生波动的一个主要因素^[10]，可以通过直接或间接的 方式影响入侵地土壤微生物群落的结构和功能多样 性，从而阻碍本土植物的生长和更新^[11]。群落多样性 作为反映土壤微生物生态学特征的关键指标^[12]，已成 为生态学研究领域的热点和焦点，其研究方法也在不 断的改进和完善^{[13, 14]}。其中，Biolog分析法通过测定微 生物对单一碳源利用程度来反映微生物群体水平的 生理特征，以此研究微生物群落的功能多样性。

本文以典型黄顶菊入侵地土壤为研究对象，采用 含有31 种不同单一碳源的Biolog-ECO 微平板检测 技术，分析碳源平均颜色变化率（A WCD）、6 类碳源利 用率、主成分分析因子载荷等指标，目的在于：（1 ）探 明黄顶菊入侵对土壤微生物群落的主要碳源利用类 型以及对不同碳源的利用情况的影响；（2 ）揭示黄顶菊 入侵后土壤微生物群落碳源利用特征的变化，以期为 阐明黄顶菊入侵的机制提供基础数据，也为黄顶菊的 预防和治理提供参考。 1 材料与方法 1.1 试验地概况

试验地位于天津市静海县黄顶菊重发区（38°35′ 30″N，116°42′45″E），海拔2.4 m。属于暖温带大陆性 季风气候，四季分明，年均气温约为11.8 ℃，年均降 水量870 mm，年均无霜期193 d，土壤类型为盐渍化 潮土，pH 偏碱。入侵样地主要伴生植物有狗尾草 （Setaira viridis）、猪毛菜（Salsola collina）、芦苇（Phragmites australis）和黄花蒿（Artemisia annua）等。 1.2 试验设计和土壤样品采集 试验地为黄顶菊危害的典型荒地生境，形状近正 方形，根据是否有黄顶菊入侵将试验区分为2 个样 地：（1 ）本土植物样地（CK）。样地内没有黄顶菊，仅生 长有本土植物；（2 ）黄顶菊入侵样地。样地内生长有黄 顶菊和本土植物，有记载的黄顶菊发生年限在5 年以 上，发生盖度在60%~100%之间。在每个样地中随机 建立5个面积为5 m×5 m的小区，每个小区为1个重 复，各小区间距离>5 m。于2012 年8 月12 日采集土 样，由于植物对土壤环境的影响受根区位置的影响， 因此入侵样地土样分根际土（rhizosphere soil，RPS）和 根围土（bulk soil，BS）取样。RPS 采用抖落法，将每个 小区中的10 个植株的根际土混合为1 个土样；BS 利 用5 点采样法，采集0~10 cm 表土，组成1 个混合土 样。在取样前去除地面植物和凋落物等有机杂质。CK 采样方法同入侵样地BS采样方法。土样装于塑料自封 袋中用冰盒带回实验室。将每个小区采集的土样过2 mm 筛后分成2 份，一份储存在-20 益冰箱，用于分子 生物学试验；一份风干用于土壤理化性质测定，理化 的测定数据为5 个重复所获结果。 1.3 试验方法 1.3.1 土壤理化性质测定

土壤有机质的测定采用重铬酸钾外加热法，全氮 含量采用半微量开氏法，铵态氮和硝态氮含量的测定 采用KCl浸提法^[15]。 1.3.2 Biolog 测定

土壤微生物功能多样性用Biolog 方法进行测 定^[16]：称取相当于10 g干土重量的新鲜土样，在超净 工作台中将土壤加入盛有90 mL 0.85% 无菌NaCl 的 三角瓶中，封口后，在摇床上250 r·min^-1震荡30 min， 静置10 min 后取5 mL 上清液加入45 mL 0.85%无菌 NaCl 溶液中，重复以上过程，将溶液稀释1 000 倍。用 8 通道加样器将稀释液接种到Biolog-ECO 生态培养 板的96 个孔中，每孔分别接种150 μL 稀释后的悬 液。将接种好的培养板放在28 ℃恒温培养箱中培养， 分别于24、48、72、96、120、144、168 h 在Biolog 微孔 板读数仪（Biolog Inc.，USA）上读取培养板在590 nm 和750 nm波长下的吸光值。 1.3.3 土壤微生物量碳、微生物量氮测定

采用氯仿熏蒸-K₂SO₄提取法，每个重复取6 份新鲜土壤，每份10 g（按干重转换），培养24 h后，3份 采用氯仿熏蒸24 h，另3份不熏蒸，加入50 mL 0.5 mol·L^-1 K₂SO₄溶液浸提土壤。应用Multi N/C 3100 总 有机碳/总氮分析仪（德国耶纳分析仪器分析公司）进 行测定^[17]。 1.4 数据分析

选取在0~2范围内的OD值进行分析^[18]。采用微 平板每孔颜色平均变化率（average well color develop原 ment，A W CD）来表示微生物整体活性，A W CD计算方 法如下：

根据Biolog-ECO 板不同反应孔的吸光值大小， 采用培养96 h的微生物代谢活性值作为土壤微生物 的特征值^[19]。计算公式如下:

选取96 h 的OD 值进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

试验数据用Excel 2003 进行处理，采用SPSS 16.0 进行多重方差分析（ANOVA）、主成分分析和相 关性分析。 2 结果与分析 2.1 黄顶菊入侵对土壤理化性质的影响

黄顶菊入侵后土壤理化性质发生显著变化（表 1）。 BS 土壤有机质和全氮含量均显著高于CK，分别比 CK 高7.72%、31.34%；而RPS 则分别比CK 高 18.53%、126.87%。但是，与CK 比，BS 的pH值和硝态 氮含量则呈现下降的趋势，且差异达均显著水平。入侵地中所有土壤养分含量均存在明显的根际效应。

表 1 黄顶菊入侵对土壤理化性质的影响 Table 1 Effects of Flaveria bidentis invasion on soil chemical and physical properties

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从培养开始计时，每隔24 h测定A W CD值，得到 该值随时间的动态变化图（图 1）。A W CD值的变化速 度（斜率）和最终能达到的AWCD 值反映了土壤微生 物利用某一碳源的能力，通常认为变化幅度较大的样 品具有较高的碳源利用能力，也常常具有较高的微生 物丰度^[20]，这在一定程度上可以反映土壤中微生物种 群的数量和结构特征。由图 1 知，A W CD的变化趋势 为：RPS >BS >CK，且除24 h外，差异均显著（P<0.05）。 从图 1 中还可以发现，随着培养时间的延长，不同处 理AWCD 值的上升快慢存在差异，黄顶菊入侵地 RPS 和BS 的A W CD值上升较快，说明碳源被迅速利 用，然而CK 的A W CD值上升却非常缓慢。这表明黄 顶菊入侵增加了土壤微生物代谢活性。

图 1 土壤微生物群落A W CD值随时间的动态变化 Figure 1 A W CD dynamics with incubation time

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土壤微生物的功能多样性是通过土壤微生物 群落物种多样性指数（H）、均匀度指数（E）、优势度 指数（D）分别来表征的。本研究采用培养96 h的数 据计算土壤微生物多样性指数，由表 2 知，CK 的H 高于BS，由于根际效应的存在，RPS 的H 也高于BS， 差异显著（P<0.05）；CK 的D 要高于BS，差异显著 （P<0.05）

表 2 土壤微生物群落多样性指数 Table 2 Diversity indices for soil microbial communities

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为了进一步了解黄顶菊入侵对土壤微生物群落 代谢能力的影响，利用培养96 h的数据，对31 种碳 源底物利用情况进行主成分分析。主成分分析中的因 子载荷值可反映不同土壤碳源利用的差异，绝对值越 大，表明该碳源的影响越大，在众多碳源中起主要分 异作用^[21]。Biolog-ECO板上的31 种碳源在前2 个主 成分上的载荷值见表 3，将Biolog-Eco-Plate 的31 种 碳源底物分为6 大类^[22]：糖类（7 种）、氨基酸类（6种）、羧酸类（9 种）、聚合物（4 种）、胺类（2 种）、代谢中产 物和次生代谢物（3 种）。由表 3 可知，第一主成分 （PC1）具有较高相关性的碳源有17 种，其中糖类5 种、氨基酸类4 种、羧酸类3 种、聚合物1 种、胺类1 种、其他3 种，表明影响第一主成分的碳源主要有糖 类、氨基酸类和羧酸类。而与第二主成分（PC2）具有 较高相关性的碳源有8 种，其中糖类1 种、氨基酸1 种、羧酸类4 种、聚合物2种，表明影响第二主成分的 碳源主要有羧酸类和聚合物。

表 3 31 种碳源的主成分载荷因子 Table 3 Loading factors of principle components of 31 sole-carbon sources

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土壤微生物群落功能主成分分析用于研究微生 物对碳源利用的特点。通过主成分分析可以在降维后 的主元向量空间中，用点的位置直观地反映出不同土 壤微生物群落功能多样性的变化^[23]。根据此原则，共 提取出了6 个主成分，累计贡献率达96.72%，表明这 6 个主成分可以解释群体总的遗传方差。其中第一主成分（PC1）贡献率是45.68%，权重最大；第二主成分 （PC2）贡献率是19.83%；第3~6 主成分贡献率分别是 12.94%、8.75%、6.13%、3.39%，因其贡献率较小，所以 以PC1 和PC2 作图，以区分不同处理间的微生物代 谢特征。

从图 2 可以看出，不同处理在PC 轴上出现了明 显的分布差异，其中RPS 土壤的微生物代谢多样性 类型具有较大的变异（分散的数据点）。同时可以看出， BS、RPS 的大部分点分布在PC2 负轴上，CK 分布在 正轴上，表明黄顶菊入侵使土壤微生物群落对碳源的 代谢特征产生了差异。

图 2 不同处理土壤微生物碳源利用主成分分析 Figure 2 Principal component analysis for carbon utilization of soil microbial communities in different treatments

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土壤微生物量是指除了植物根系和体积大于5× 10³μm³的土壤动物以外的土壤中所有活有机体的生 物量^[24]。从图 3 可以看出，黄顶菊入侵之后，土壤微生 物量碳、氮均显著上升（P<0.05）。其中，入侵样地BS 和RPS 的微生物量碳分别比CK 高27.05% 、 121.52%；BS 和RPS 的微生物量氮分别比CK 高 37.4%、79.80%。

图 3 土壤微生物量碳、微生物量氮 Figure 3 Microbial biomass carbon,nitrogen of soil in sampling sites

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将96 h平均颜色变化率（A W CD）、多样性指数 （H）、均匀度指数（E）、Simpson优势度指数（D）与土壤 微生物量碳、微生物量氮进行相关分析。如表 4 所示， A W CD与微生物量碳和微生物量氮均呈极显著正相 关（P<0.01），多样性指数（H）与优势度指数（D）呈显 著负相关（P<0.05）。

表 4 土壤微生物功能多样性与土壤微生物量的相关性 Table 4 Correlative coefficients among soil microbial functional diversity and soil microbial biomass

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植物对土壤环境的重要影响之一是改变土壤微 生物群落特征。外来入侵植物可以通过根系分泌物、 淋溶物、凋落物腐解等释放化感物质进入土壤，改变 土壤养分和微生物，从而获得竞争优势^[25]。这种变化 可能促进其入侵并抑制其他植物的生长。Biolog方法 用于环境微生物群落的研究，具有灵敏度高，分辨能 力强；无需对微生物进行纯种分离培养；且测定方法 简便等优点。可通过对多种单一碳源利用的测定得到 被测微生物群落的代谢特征，分辨微生物群落微小的 变化，也可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢 特征，该方法已经被广泛应用于评价土壤微生物总的功能多样性^[26]。由于Biolog方法主要依赖于微生物群 体的生理活性，作为研究微生物群落功能多样性的方 法仍然存在一些不足，如该方法较适用于检测和鉴定 土壤中快速生长或富营养微生物类群的活性，而不适 于反映土壤中生长缓慢或不能培养的微生物信息；土 壤微生物在Biolog 板内生长时，由于湿度、渗透压和 pH值等的变化，会引起微生物对碳源底物实际利用 能力的改变^[27]。本文中的土壤微生物功能多样性主要 是从碳源利用角度阐述的，指的是土壤整体微生物代 谢功能的多样性。而土壤功能微生物多样性则是应用 分子生物学技术（如DGGE、T-RFLP 和RT-PCR 等） 对某一基因序列及其特征表达的功能信息，来判定土 壤中的功能菌群，诸如现在已经比较熟悉的氨氧化细 菌、反硝化细菌、甲烷氧化菌等，进而分析其结构、遗 传等多样性。

土壤微生物群落对Biolog 微平板中各类碳源利 用情况的差异反映了土壤中微生物群落代谢功能的 不同^[28]。碳源平均颜色变化率及其功能多样性指数可 以反映土壤微生物的活性及其功能多样性^[19]。本研究 中，土壤微生物群落平均吸光值（A W CD）表现为 RPS>BS>CK。较高的A W CD值意味着土壤微生物群 落有更高的能力去代谢不同的简单分子底物，反映了 土壤微生物群落拥有较高的代谢活性。由此可知，黄顶 菊入侵增强了土壤微生物的代谢活性。这与陈华^[29]、 鲁海燕^[30]的研究结果相似。在特定的生长环境内，土 壤微生物群落可以形成与本地植物相对协调稳定的 生态关系，然而土壤微生物群落也是易变的，它会受 到外来植物入侵和植物群落多样性变化的影响^[31]。于 兴军等^[32]应用Biolog-Ecoplate^TM方法测定了紫茎泽兰 （Eupatorium adenophorum）入侵对土壤细菌群落特征 的影响，结果显示改变土壤细菌群落可能是紫茎泽兰 入侵过程中的一个重要组成部分，外来入侵植物可以 通过改变入侵地土壤微生物群落结构，阻碍本地植物 的生长和更新。本研究发现，黄顶菊入侵降低了土壤 微生物代谢功能的多样性，但存在明显的根际效应。 根际效应是由于植物根系产生的分泌物和脱落物为 根际区土壤微生物提供有效碳源和氮源，因而根际的 土壤微生物在数量和种群上比非根际土壤微生物多， 并随之带来一系列土壤生化过程的连锁效应，导致根 际土壤理化性质与生物学特性不同于非根际土壤，即 表现出根际效应（rhizosphere effects）^[33]。同时，本文的 主成分分析表明，黄顶菊入侵改变了土壤微生物群落 对碳源的代谢特征。

土壤微生物量在很大程度上能够反映出土壤微 生物的活性，常被用来评价微生物的活性参数^[34]。有研 究发现外来入侵植物豚草（Ambrosia arte misiifolia）^[35]和 绿毛山柳菊（Hieracium pilosella）^[36]的入侵提高了土壤 微生物量碳、氮的含量。本研究也发现，黄顶菊入侵地 土壤微生物量碳、氮含量明显高于CK，且存在明显的 根际效应。这表明黄顶菊入侵样地微生物活动要比CK 的强烈，土壤碳源、氮源的平均可利用性也要比CK的 高。本研究的相关性分析表明，A W CD与微生物量碳、 氮均呈极显著正相关。由此说明土壤微生物代谢活性 的变化可能是导致土壤微生物量变化的主要原因。有 研究发现，植物凋落物的增加为土壤提供了丰富的有 机物质，促进了土壤微生物的大量繁殖^[37]。黄顶菊入 侵后能够快速形成单优群落，且生物量大，地上凋落 物向土壤输入增多，导致土壤微生物代谢活性增强，土 壤微生物量的增加。 4 结论

总体来说，黄顶菊入侵增强了土壤微生物的代谢 活性，提高了土壤微生物量，降低了BS 微生物的功 能多样性，但增加了自身RPS 微生物的功能多样性 水平。这种变化可能利于黄顶菊在抑制本地植物生长 的同时增强自身竞争能力，实现进一步成功入侵。