黄顶菊（Flaveria bidentis（L.）Kuntze）为近年来入 侵我国的世界性恶性杂草，原产南美洲，广泛分布于 亚洲、欧洲和非洲20 多个国家及地区^[1]，2003 年首次 发现侵入到我国河北衡水湖自然保护区，目前已扩散 到河北、河南、山东及天津92个县市^{[2, 3]}。黄顶菊侵占农 田、林地，造成农作物严重减产，抑制种苗生长。土壤是 入侵植物黄顶菊与作物间进行互作、共生的基本环 境，土壤中不同功能的微生物扮演着不同的角色，为植 物的生长提供物质和能量来源。近年来有研究发现，黄 顶菊的入侵改变了土壤微生物群落结构，提高了土壤 有机质、全氮、硝态氮和铵态氮的含量，降低了土壤中 有效磷的含量^{[4, 5]}。越来越多的相关研究也表明，土壤微 生物群落的变化与外来植物成功入侵有很大关系^{[6, 7]}，有研究发现，入侵植物可改变土壤中与养分代谢相关 的一些功能微生物类群，形成逆向正反馈，从而制造 对入侵植物自身有利却危及本地物种的土壤微生态 环境^[8]。

已有研究表明，化感作用是黄顶菊成功入侵的重 要因素之一，其化感物质主要通过植株残体和根系分 泌向环境中释放，植株残体、根系分泌途径的平均综 合化感效应分别为29.54、17.20，其植株残体分解和根 系分泌产生的化感物质会长期存在于土壤中，改变土 壤环境^[9]。目前关于黄顶菊入侵对土壤微生物影响的研 究，更多的集中在入侵前后细菌、真菌和放线菌等主 要微生物的数量变化上^{[4, 10, 11]}，而对于各类微生物种群 结构和功能的具体变化，特别是主要功能性细菌的变 化则未见报道。黄顶菊的入侵降低了土壤中有效磷的 含量^{[4, 5]}，这可能是由于其对有效磷有较强的吸收和利 用能力，但也不排除黄顶菊化感分泌物对土壤微生物 功能类群的改变而引起土壤养分形态和含量变化的 可能性^[12]。因此，对黄顶菊入侵后土壤特定功能微生物， 如磷细菌等的变化规律研究将有助于深入了解黄顶 菊入侵的微生态机制。

本试验利用选择性培养基，对黄顶菊入侵前后土 壤中的磷细菌进行分离筛选，并采用细菌基因组重复 序列PCR（rep-PCR）技术进行聚类分析，研究黄顶菊 入侵对土壤中磷细菌多样性的影响，为阐明黄顶菊入 侵的土壤微生物学机制提供一定的理论依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料

黄顶菊种子于2011 年11 月采集于河北省衡水 湖地区，室温储存备用。

试验所需培养用土于2012 年11 月采于天津市 静海县（38°56′N，117°08′E，海拔-7 m），该地区属暖 温带半湿润大陆性季风气候，季风显著，四季分明。年 平均气温13 益，年均降水量870 mm，入侵地的主要 伴生植物有狗尾草（Setariaviridis）、猪毛菜（Salsola collina）、芦苇（Phragmites australis）、黄花蒿（Artemisia annua）等。取样地的土壤类型为盐渍化潮土（pH=8.36）， 有机质含量22.32 g·kg^-1，总氮0.88依0.05 g·kg^-1。选取 黄顶菊未入侵的地块，去除地面植被和地表凋落物后 取地表（0~20 cm）土壤，除去土壤中的残留根系、石块 及其他杂物，混匀过筛（2 mm）后备用。 1.2 试验方法

选取成熟饱满的黄顶菊种子，播种于育苗钵土表， 育苗备用。将采集的土壤装于盆钵（15 cm×12 cm）。取 大小一致、长势良好的黄顶菊幼苗（4~6 叶龄）移栽到 盆钵中，每盆3株，以不移栽黄顶菊为对照。所有盆钵 随机摆放，并定时挪动位置，隔日浇水。

待到整个生长期结束后，选择长势近似一致的5 盆黄顶菊植株，将植株拔出，取盆钵中距土表深度为 2~5 cm厚的土壤，充分混匀，作为待测土壤样品。对照 组不种植植物，采用与处理组相同的方法采样^[5]。 1.3 测定指标及方法 1.3.1 磷细菌的分离筛选与计数

采用涂布平板法分离土壤中的无机磷细菌和有 机磷细菌，并对菌落进行计数，所用培养基分别为磷 酸三钙无机磷细菌培养基和有机磷细菌培养基^[13]。 1.3.2 磷细菌的rep-PCR 基因指纹分析

利用平板划线法将筛选出来的细菌进一步分离 纯化。挑取纯化后的单菌落接种于LB液体培养基中， 37 ℃震荡培养。取1 mL菌液离心（11 500×g，1 min）收 集菌体。使用细菌DNA提取试剂盒（天根生化科技有限 公司）提取DNA。rep-PCR扩增反应所使用的引物序列 为：ERIC1R（5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'） 和ERIC2（5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'）^{[14, 15]} （上海生工生物工程有限公司），以提取的细菌DNA 为模板，进行PCR 扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶电 泳。 1.3.3 磷细菌的多样性分析

选取物种丰富度指数（S）、香农-威纳多样性指数 （H'）和物种均匀度指数（J）来分析磷细菌的多样性变

磷细菌筛选计数结果用t 测验进行差异显著性 检验。琼脂糖凝胶电泳所得的电泳图谱通过 Quantity One 软件（Bio-Rad）对图谱中各菌株条带进 行处理，获得近似分子量，据此得到磷细菌的种类数并采用物种丰富度指数（S）、香农-威纳多样性指数 （H'）和物种均匀度指数（J）来评价土壤样品的多样性 特征。 2 结果与分析 2.1 黄顶菊入侵对磷细菌数量的影响

黄顶菊入侵对土壤中磷细菌数量的影响结果见 表 1。可以看出，黄顶菊入侵后土壤中无机磷和有机 磷细菌的数量均有所增加，其入侵后数量分别为入侵 前的1.17 倍和1.08 倍，但2种磷细菌数量的变化均 未达到显著水平。

表 1 黄顶菊入侵对土壤磷细菌数量的影响 Table 1 Effects of F. bidentis invasion on the quantity of phosphorus bacteria in soil

表选项

从黄顶菊入侵前后土壤中共获得无机磷细菌分 离株22个（入侵前10个、入侵后12 个），有机磷细菌 分离株20 个（入侵前9 个、入侵后11 个），rep-PCR 扩增结果如图 1、图 2 所示。对2 种细菌分离株进行 rep-PCR 基因指纹分析，构建rep-PCR 基因指纹分析 图，结果见图 3、图 4。

图 1 无机磷细菌的rep-PCR 扩增结果 Figure 1 Amplification results of rep-PCR of inorganic phosphorus bacteria

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图 2 有机磷细菌的rep-PCR 扩增结果 Figure 2 Amplification results of rep-PCR of organic phosphorus bacteria

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图 3 无机磷细菌的rep-PCR 聚类分析图 Figure 3 Cluster analysis of rep-PCR fingerprints of inorganic phosphorus bacteria

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图 4 有机磷细菌的rep-PCR 聚类分析图 Figure 4 Cluster analysis of rep-PCR fingerprints of organic phosphorus bacteria

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土壤中无机磷细菌的rep-PCR 基因指纹分析如 图 3所示，第17 聚类群各自所包含的分离物具有完 全一致的rep-PCR 指纹图谱，其余菌株都有各自的 特征谱带，因此，在种的水平上，无机磷细菌被分为 20 个聚类群，其中包括入侵前的10 个聚类群，入侵 后的11个聚类群，说明黄顶菊入侵后增加了土壤中 无机磷细菌的的种类。其中第1、5、9、10、11、14、15、 16 和18 个聚类群只存在于黄顶菊入侵前土壤中，第 2、3、4、6、7、8、12、13、19 和20 个聚类群只存在于黄 顶菊入侵后土壤中，第17 个聚类群在2 种土壤中都 存在。 2.2.2 有机磷细菌的rep-PCR 基因指纹分析

土壤中有机磷细菌的rep-PCR 基因指纹分析如 图 4 所示，各聚类群没有完全一致的rep-PCR 指纹 图谱，因此，在种的水平上，有机磷细菌被分为20 个 聚类群，其中包括入侵前的9 个聚类群，入侵后的11 个聚类群，说明黄顶菊入侵后增加了土壤中有机磷细 菌的的种类。其中，第5、6、8、9、10、11、12、13和16 个 聚类群只存在于黄顶菊入侵前土壤中，第1、2、3、4、 7、14、15、17、18、19 和20 个聚类群只存在于黄顶菊 入侵后土壤中，两种土壤中没有共有的聚类群。 2.3 磷细菌的多样性分析

黄顶菊入侵前后土壤中磷细菌的丰富度指数 （S）、香农-威纳多样性指数（H'）和物种均匀度指数 （J）见表 2。可以看出，黄顶菊入侵后土壤中无机磷和 有机磷细菌的丰富度指数和香农-威纳多样性指数均 高于入侵前；而黄顶菊入侵后土壤中无机磷细菌的物 种均匀度指数低于入侵前，有机磷细菌的物种均匀度 指数入侵前后相等。这说明黄顶菊入侵后影响了土壤中磷细菌群落的结构，改变了土壤中无机磷细菌和有 机磷细菌的多样性特征。

表 2 磷细菌的物种丰富度、香农-威纳多样性及均匀度指数 Table 2 The species richness index,shannon index and species evenness index of phosphorus bacteria

表选项

磷是植物生长发育不可缺少的大量元素之一，但 是土壤中的磷绝大部分不能被植物直接吸收，而是需 要通过解磷微生物（主要是解磷细菌）将其转化为可 吸收利用的形态。磷细菌与土壤中磷的转化、贮存与 供应直接相关，在改善土壤供磷性能方面起着极重要 的作用^[16]。解磷菌的解磷机制因不同的菌株而有所不 同。有机磷细菌在土壤缺磷的情况下，向外分泌植酸 酶、核酸酶和磷酸酶等，将有机态的磷水解为无机磷 酸盐。无机磷细菌的解磷机制一般认为与其产生的有 机酸有关，这些有机酸能够降低pH 值，并与铁、铝、 钙、镁等离子结合，从而增加难溶性的磷酸盐的溶解 度^[17]。

目前已有关于入侵植物对土壤中磷细菌数量和 有效磷含量影响的报道。空心莲子草入侵后显著增加 了土壤中可培养细菌的数量和土壤中有效磷的含 量^[18]；紫茎泽兰入侵后土壤中有机磷细菌和无机磷细 菌等主要功能微生物的数量均显著高于本地植物土 壤^[19]，相对于未入侵区和轻度入侵区，紫茎泽兰重度 入侵区中土壤中有效磷含量显著增加^{[19, 20, 21]}。前人研究 表明，黄顶菊入侵降低了土壤中有效磷含量^{[4, 5]}，而对 于入侵后土壤中磷细菌的变化尚未见报道。本研究发 现，黄顶菊入侵后土壤中有机磷和无机磷细菌的数量 均高于入侵前。磷细菌数量增加而有效磷含量降低， 二者之间似乎趋势相反。分析原因可能是由于黄顶菊 入侵后增加了土壤中磷细菌数量，进而加速磷细菌对 土壤磷的转化作用，从而提高土壤有效磷含量，但可 能由于入侵植物本身具有生长速度快和养分吸收能 力强的特性^{[22, 23]}，促使磷消耗速度加快，最终导致土壤 中有效磷含量的降低。而土壤有效磷含量的降低也会 抑制其他植物的生长，使其在竞争中处于劣势而逐步 被入侵植物取代^[24]。

黄顶菊入侵后土壤中2 种磷细菌的丰富度指数 和多样性指数增加，而物种均匀度指数或降低或不 变，有研究表明，在特定的前提下，多样性可以导致稳 定性^[25]。黄顶菊这种变化趋势说明其入侵使土壤中的 磷细菌形成了相对更为协调稳定的生态分布：群落结 构更加复杂，物种多样性更加丰富，总体分布更加均 匀。这种微生物群落结构的改变有可能打破当地土壤 不同养分之间的平衡，形成有利于黄顶菊自身生长而 不利于其他植物生长的微生态环境，以便于其种群进 一步扩张^[21]。 4 结论

通过涂布平板法、rep-PCR 聚类以及多样性分析等手段，研究了黄顶菊入侵前后土壤中磷细菌的变化 趋势，结果表明，黄顶菊入侵后增加了土壤中无机磷 和有机磷细菌的数量，其数量入侵后分别为入侵前的 1.17 倍和1.08 倍；黄顶菊入侵后土壤中无机磷细菌 的丰富度指数、香农-威纳多样性指数分别为11 和 2.369，高于入侵前的10 和2.303；有机磷细菌的丰富 度指数、香农-威纳多样性指数分别为11 和2.398，高 于入侵前的9和2.197，而2种细菌的物种均匀度指 数基本不变。黄顶菊入侵后土壤中2 种磷细菌的数量 和种类均有所增加，这说明黄顶菊使土壤磷细菌多样 性更加丰富，分布更加均匀。研究结果为探究黄顶菊 入侵的微生态机制提供了理论依据，对于创新外来入 侵植物防控技术和方法具有重要的指导意义。